在神经母细胞瘤的细胞和小鼠模型中，表达目标抗原的细胞外囊泡能够提升CAR T细胞的疗效

《Science Translational Medicine》：Target antigen–displaying extracellular vesicles boost CAR T cell efficacy in cell and mouse models of neuroblastoma

　　神经母细胞瘤来源的外泌体携带抗原GPC2和GD2，可激活相应CAR T细胞并增强疗效。通过工程化合成外泌体（SyntEVs）结合白蛋白或GD2，可延长循环时间并促进肿瘤浸润，显著提升CAR T细胞持久性和抗肿瘤效果，为实体瘤免疫治疗提供新策略。

　　CAR T细胞疗法在血液恶性肿瘤中展现出显著的治疗效果，但在实体瘤中的应用却受到多种因素的限制，其中T细胞的持续性不足和肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性尤为关键。针对这一问题，近期的研究揭示了神经母细胞瘤细胞释放的细胞外囊泡（EVs）在增强CAR T细胞疗法中的潜在作用。这些EVs携带肿瘤抗原如糖蛋白Glypican-2（GPC2）和双唾液酸神经节苷脂GD2，并能够激活针对这些抗原的CAR T细胞。通过进一步研究，研究人员发现肿瘤来源和合成来源的GPC2携带EVs可以显著提高CAR T细胞在体外和体内的持续性和抗肿瘤能力，从而为克服实体瘤治疗中的挑战提供了新的思路。

神经母细胞瘤是一种高风险的儿童癌症，尽管采用多种治疗手段，但其长期生存率仍低于50%。GPC2和GD2作为神经母细胞瘤的免疫治疗靶点，已被广泛研究。然而，CAR T细胞在实体瘤中的治疗效果仍然有限，主要由于抗原异质性、T细胞持续性不足以及TME的免疫抑制作用。在TME中，肿瘤细胞释放的EVs可以作为细胞间通讯的媒介，通过携带免疫调节蛋白和抗原，影响CAR T细胞的功能。例如，一些EVs可能具有免疫原性，能够将抗原转移到树突状细胞，从而激活细胞毒性T细胞；而另一些EVs则可能携带抑制性检查点分子或免疫抑制性细胞因子，显著抑制免疫细胞的活性。

为了探索EVs在CAR T细胞治疗中的作用，研究人员首先分析了神经母细胞瘤来源的EVs的表面蛋白组成，发现这些EVs富含GPC2和GD2，同时PD-L1的表达水平较低。这一特性使得神经母细胞瘤EVs在促进CAR T细胞激活方面具有独特优势。此外，研究团队还发现，这些EVs在肿瘤携带者的血液中可以被检测到，并且其数量与肿瘤负荷和抗原表达水平密切相关。这些发现表明，GPC2和GD2在神经母细胞瘤EVs上的表达可能为CAR T细胞提供额外的抗原刺激，从而增强其抗肿瘤能力。

接下来，研究人员通过体外实验验证了GPC2和GD2携带EVs对CAR T细胞的激活作用。结果显示，携带GPC2的EVs能够特异性地与GPC2靶向的CAR T细胞结合，并促进其活化和细胞毒性。类似地，GD2携带的EVs也能激活GD2靶向的CAR T细胞。这些实验进一步表明，EVs作为抗原载体，能够增强CAR T细胞的反应，提高其对肿瘤细胞的杀伤能力。

为了评估EVs在体内对CAR T细胞治疗效果的影响，研究团队构建了多种实验模型。通过CRISPR-Cas9技术敲除RAB27A基因，该基因在EV释放中起关键作用，研究人员观察到，缺乏EV释放的肿瘤生长速度明显减缓，这表明EVs在肿瘤生长中可能起到一定作用。然而，当将携带GPC2的EVs与CAR T细胞联合使用时，肿瘤控制效果显著提高，显示出EVs在增强CAR T细胞体内活性方面的潜力。此外，使用药物GW4869抑制EV分泌后，联合使用携带GPC2的EVs能够部分恢复CAR T细胞的治疗效果，进一步验证了EVs在促进CAR T细胞功能中的重要性。

为了进一步提高EVs的治疗效果，研究团队设计了“装甲”EVs，通过工程化手段使其能够与血清白蛋白或GD2结合。这种策略旨在延长EVs在体内的循环时间，提高其对肿瘤的渗透能力。结果显示，与血清白蛋白结合的EVs在体内循环时间更长，能够有效提升CAR T细胞的外周增殖和抗肿瘤活性。而与GD2结合的EVs则能够通过增强肿瘤细胞表面GPC2的表达，提高CAR T细胞对低抗原表达肿瘤的杀伤能力。这些结果表明，通过优化EVs的表面特性，可以显著增强其作为CAR T细胞增强剂的潜力。

此外，研究团队还通过动物实验验证了这些“装甲”EVs的治疗效果。在携带人类神经母细胞瘤细胞系的NSG小鼠模型中，联合使用携带GPC2的EVs显著延长了CAR T细胞的生存时间，并有效抑制了肿瘤生长。特别是在某些实验中，联合使用携带GD2的EVs能够提高肿瘤细胞表面GPC2的表达，从而增强CAR T细胞的抗肿瘤活性。这些实验不仅验证了EVs在促进CAR T细胞功能方面的潜力，还为未来在实体瘤治疗中的应用提供了依据。

研究还探讨了EVs在临床中的应用前景。由于EVs能够作为非侵入性生物标志物，检测其在血液中的含量可能有助于评估患者的肿瘤负荷和治疗反应。此外，EVs作为抗原递送载体，可以为CAR T细胞提供额外的刺激信号，提高其在免疫抑制环境中的活性。通过进一步优化EVs的表面蛋白组成，可以使其成为更有效的CAR T细胞增强剂。

尽管研究取得了一些突破，但仍存在一些局限性。例如，使用免疫缺陷小鼠模型可能无法完全反映EVs在免疫正常环境中的作用。因此，未来的研究需要在免疫正常的小鼠模型中进行，以更全面地评估EVs对内源性免疫细胞的影响。此外，EVs的生产与修饰过程可能较为复杂，需要进一步优化以提高其在临床中的应用可行性。然而，由于HEK293T细胞易于进行稳定的基因修饰，它们被广泛用于EVs的大规模生产，为未来的临床转化提供了可能。

综上所述，这项研究揭示了神经母细胞瘤来源的EVs在CAR T细胞治疗中的重要性。通过分析这些EVs的表面蛋白组成和功能特性，研究人员发现它们能够作为有效的抗原递送载体，激活CAR T细胞并增强其抗肿瘤能力。此外，通过工程化手段，如与血清白蛋白或GD2结合，可以进一步提高EVs的治疗效果。这些发现不仅为改善CAR T细胞疗法在实体瘤中的应用提供了新的策略，还为未来在其他肿瘤类型中的研究奠定了基础。EVs作为CAR T细胞的辅助剂，其在肿瘤免疫治疗中的潜力值得进一步探索和验证。