通过磷酸化和脱酰胺方法对草豌豆（Lathyrus sativus L.）蛋白进行化学修饰：对其结构和技术功能特性的比较研究

《Applied Food Research》：Chemical modification of grass pea ( Lathyrus sativus L.) protein through phosphorylation and deamidation methods: A comparative study on structural and techno-functional properties

　　草豌豆蛋白 isolate（GPPI）通过磷酸化（2% STMP，pH 11.5）和脱酰胺化（0.13 M醋酸，121°C）改性，结构分析（FTIR、XRD、CD、荧光光谱、FESEM）显示磷酸化增加-O-P和-N-P键，破坏氢键；脱酰胺化将-CONH2转为-COOH，减少α螺旋和β折叠，增加β转角和随机卷曲。功能特性测试表明，脱酰胺化后的DGPP发泡能力（92%±0.86%）和乳化活性（EAI 92±0.81 m2/g，ESI 74±2.16 min）最优，而磷酸化后PGPP的zeta电位（31.65±0.68 mV）和持水能力（3.06±0.11 g/g）显著提升。研究证实两种改性均有效改善GPPI功能特性，但脱酰胺化在提升溶解性（DGPP达最高值）和乳化稳定性方面更优，为植物蛋白应用提供新策略。

　　### 草豌豆蛋白的结构与功能特性改善研究

草豌豆蛋白（Grass Pea Protein Isolate, GPPI）因其丰富的营养价值和较低的成本，正逐渐成为食品工业中替代动物蛋白的重要资源。然而，由于其技术功能特性受限，例如较低的溶解性、较差的泡沫形成能力以及较弱的乳化性能，草豌豆蛋白在食品体系中的应用受到一定限制。为了解决这些问题，本研究探讨了通过磷酸化和脱酰胺两种化学修饰方法对GPPI结构和功能特性的影响。通过多种分析手段，包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、荧光光谱、场发射扫描电镜（FESEM）和圆二色光谱（CD）等，确认了这两种处理方法的有效性，并揭示了它们对蛋白质结构和功能特性产生的具体变化。

### 化学修饰的原理与应用

磷酸化是一种常见的化学修饰方法，通过在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基（-OH）或赖氨酸的氨基（-NH?）上引入磷酸基团，形成磷酸酯键。这一过程能够改变蛋白质的电荷分布，增强其亲水性，并改善其与其他成分的相互作用能力。在本研究中，使用了2%的三聚磷酸钠（STMP）在pH 11.5的条件下对GPPI进行磷酸化处理。结果显示，磷酸化显著提升了GPPI的ζ电位，从25.78 ± 0.53 mV增加到31.65 ± 0.68 mV，表明磷酸基团的引入增强了蛋白质的表面电荷，从而改善了其在水中的分散性和溶解性。

脱酰胺则是一种通过酸性条件（如醋酸）将天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的酰胺基团转化为羧基（-COOH）的化学处理方法。这种变化不仅改变了蛋白质的电荷特性，还影响了其二级结构和三级结构，从而提升了其功能特性。在本研究中，使用了0.13 M的醋酸在121°C下处理GPPI，使其脱酰胺程度达到21.95 ± 0.27%，并且ζ电位进一步提高至37.34 ± 0.89 mV。这些变化表明，脱酰胺过程不仅增加了蛋白质的电荷密度，还通过削弱氢键和增强静电排斥力，提升了蛋白质的结构灵活性和功能表现。

### 结构分析与功能特性变化

通过FTIR光谱分析，可以观察到磷酸化和脱酰胺处理后蛋白质结构的变化。在GPPI中，主要的吸收峰位于1652 cm?1（酰胺I）、1516 cm?1（酰胺II）和1217 cm?1（酰胺III），这些峰对应于蛋白质中的氢键和二级结构。而磷酸化处理后，新的吸收峰出现在881 cm?1和530 cm?1，分别对应于氧-磷（O-P）和氮-磷（N-P）的振动，表明磷酸基团成功引入到蛋白质结构中。此外，酰胺I峰的强度增加，说明磷酸化促进了蛋白质结构的展开，从而增强了其与水的相互作用。

相比之下，脱酰胺处理导致酰胺I和酰胺II峰的强度降低，这可能是因为酰胺基团被转化为羧基，从而破坏了原有的氢键结构。这种结构变化不仅影响了蛋白质的二级结构，还使其三级结构更加开放，增加了疏水性基团的暴露程度。脱酰胺处理后的蛋白质在表面表现出更高的电荷密度，这有助于提升其在食品体系中的功能表现。

### 荧光光谱与结构变化

荧光光谱是评估蛋白质三级结构变化的重要工具。在本研究中，GPPI的荧光最大发射波长为330 nm，而磷酸化和脱酰胺处理后，这一波长分别红移至333 nm。这种红移表明，蛋白质的三级结构在处理过程中发生了部分展开，使得色氨酸残基更容易暴露于水环境中。色氨酸残基的暴露不仅影响了蛋白质的荧光强度，还可能增强了其与水分子的相互作用能力。

磷酸化处理显著提高了荧光强度，这可能是由于磷酸基团的引入增加了蛋白质表面的亲水性基团数量，并促进了蛋白质结构的展开。而脱酰胺处理后，荧光强度进一步提升，表明其对蛋白质结构的改变更为显著。这种结构的改变不仅影响了蛋白质的物理特性，还可能提升了其在食品中的应用潜力。

### X射线衍射分析

X射线衍射（XRD）分析用于研究蛋白质的有序结构（结晶）和无序结构（非晶态）。在本研究中，GPPI、磷酸化处理后的PGPP和脱酰胺处理后的DGPP均表现出两个相似的衍射峰，表明其整体结构仍保持一定的有序性。然而，磷酸化处理后的PGPP衍射峰强度降低，说明其结构变得更加无序，这可能与磷酸基团的引入和氢键的破坏有关。脱酰胺处理后的DGPP则表现出更显著的无序结构，其衍射峰强度进一步降低，表明脱酰胺过程对蛋白质结构的改变更为彻底。

### 场发射扫描电镜分析

场发射扫描电镜（FESEM）用于观察蛋白质表面形态的变化。GPPI表现出不规则的簇状结构和较高的紧密度，而磷酸化处理后的PGPP则呈现出更光滑的表面和更小的结构，这可能与其结构展开和疏水性降低有关。脱酰胺处理后的DGPP则表现出更粗糙的表面、更分散的颗粒分布以及更高的孔隙率，这表明脱酰胺过程不仅改变了蛋白质的表面电荷特性，还促进了其结构的进一步展开。

### 氨基酸组成分析

通过氨基酸组成分析，可以进一步了解磷酸化和脱酰胺处理对蛋白质分子结构的影响。在GPPI中，谷氨酸和天冬氨酸是含量最高的两种氨基酸，而半胱氨酸和蛋氨酸则相对较低。脱酰胺处理后，DGPP中的谷氨酸含量显著增加，达到22.43 ± 0.11%，这可能是由于谷氨酰胺的酰胺基团被转化为谷氨酸的羧基基团。此外，脱酰胺处理还提高了DGPP中必需氨基酸的总含量，表明其在营养特性方面有所提升。

磷酸化处理对必需氨基酸含量的影响较小，说明这一过程主要改变了蛋白质的表面电荷和结构，而对其内部氨基酸组成影响有限。这种特性使得磷酸化处理在保持蛋白质营养价值的同时，提升了其功能特性。

### 功能特性分析

在功能特性方面，磷酸化和脱酰胺处理均显著改善了GPPI的溶解性、泡沫形成能力、乳化活性和乳化稳定性。其中，脱酰胺处理后的DGPP在这些功能特性中表现出最优的结果，其泡沫形成能力（92 ± 0.86%）和泡沫稳定性（73.33 ± 1.24%）均高于其他处理样品。此外，DGPP的乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）分别为92 ± 0.81 m2/g和74 ± 2.16 min，表明其在乳化能力方面具有显著优势。

磷酸化处理后的PGPP同样表现出较好的功能特性，其泡沫形成能力和稳定性分别达到84.83 ± 0.62%和65 ± 0.81%。这可能与磷酸基团的引入增强了蛋白质的亲水性和电荷密度有关，从而提高了其在水-油界面的吸附能力。此外，磷酸化处理还提升了PGPP的水保持能力（WHC）和油保持能力（OHC），这表明其在食品体系中的应用潜力较大。

### 结论

本研究通过磷酸化和脱酰胺两种化学修饰方法，成功改善了草豌豆蛋白的结构和功能特性。结构分析表明，这两种处理方法均导致蛋白质的二级结构和三级结构发生变化，使得蛋白质更加无序，并增强了其与水和油的相互作用能力。功能特性分析进一步证实了这些结构变化对蛋白质在食品中的应用具有积极影响。其中，脱酰胺处理在提升溶解性、泡沫形成能力和乳化活性方面表现尤为突出，而磷酸化处理则在提高电荷密度和水保持能力方面具有优势。

尽管磷酸化和脱酰胺处理均能有效改善草豌豆蛋白的功能特性，但它们在实际应用中仍面临一些挑战。例如，磷酸化处理通常需要较高的能量和较长的反应时间，这可能限制其在工业上的应用。而脱酰胺处理虽然功能提升显著，但也可能引发过度水解和蛋白质质量的下降。因此，未来的研究应致力于优化脱酰胺处理的条件，以实现更高效的功能提升，同时确保其在食品加工过程中的安全性和稳定性。通过进一步探索这两种处理方法的潜力，草豌豆蛋白有望在食品工业中发挥更大的作用，成为一种更加可持续的蛋白质来源。