通过冰冻处理方法分离高纯度肌肉干细胞，用于生产细胞培养肉

《Current Research in Food Science》：Isolation of high-purity muscle stem cells through ice-cold treatment method for the production of cell cultured meat

　　细胞体外培养肉（CCM）生产的关键在于高效分离和纯化猪肌肉干细胞（MuSCs）。本研究采用冰冷处理（ICT）方法，通过优化30分钟低温处理时间，成功实现MuSCs的高效分离与纯化。实验表明，该处理方法能显著提高细胞增殖率（较20分钟组提升35%，较40分钟组提升28%），并维持PAX7、MYOD等干细胞标志性基因的高表达水平。通过微载体培养技术，实现了MuSCs的规模化扩增（7天增殖倍数达120倍），并成功制备出与真实猪肉具有相似硬度（129.8N vs 95.3N）和弹性模量（0.63 vs 0.57）的肉丸。该技术相较于传统FACS分选法，成本降低约60%，细胞活力维持时间延长至P4代，为CCM工业化生产提供了创新解决方案。

　　细胞培养肉（Cell Cultured Meat, CCM）作为未来肉类市场的重要替代品，因其可追溯的来源和环保特性而备受关注。随着全球人口的持续增长，对可持续食品来源的需求也日益增加，而CCM技术正逐步成为满足这一需求的前沿解决方案之一。在这一背景下，如何高效、低成本地获取具有高纯度和干细胞特性的肌肉干细胞（Muscle Stem Cells, MuSCs）成为CCM生产的关键环节。传统方法在MuSCs的分离与纯化过程中常常面临诸多挑战，例如操作复杂、成本高昂、细胞纯度低以及干细胞特性受损等问题。因此，本研究旨在探索一种新的冰冷处理（Ice-Cold Treatment, ICT）方法，用于分离和纯化猪源MuSCs，并进一步研究其在体外扩增与分化过程中的特性。

ICT方法的提出基于MuSCs在骨骼肌损伤修复中的生物学特性。研究表明，MuSCs相较于其他细胞类型（如上皮细胞和成纤维细胞）具有较低的粘附能力，同时也表现出较强的迁移能力。这一特性使得在低温环境下，MuSCs能够更快地脱离细胞基质，从而实现与非目标细胞的分离。早期的实验表明，低温可以降低细胞表面粘附分子的表达水平，进而影响细胞的附着能力。因此，通过将细胞培养基置于接近0°C的环境中，能够有效促进MuSCs的分离，同时减少对细胞的机械损伤，从而保持其干细胞特性。此外，ICT方法在操作上更为简便，不需要复杂的仪器设备，也避免了传统细胞分选技术（如荧光激活细胞分选FACS和磁珠分选MACS）对细胞造成的潜在损害。

本研究中，研究人员采用ICT方法对猪源肌肉组织进行处理，以分离出高纯度的MuSCs。首先，从一周龄的猪仔中获取股二头肌和竖脊肌组织，并在无菌条件下进行酶解处理，使其分解为0.5–1.5 mm3的小块。随后，将这些组织块接种于未涂覆的细胞培养皿中，经过预贴法（pre-plating）后，再将培养皿置于0°C环境中进行不同时间的ICT处理。结果显示，经过30分钟ICT处理后获得的细胞具有最高的增殖速率和最佳的活性表现。相比之下，仅经过20分钟ICT处理的细胞增殖能力较弱，且在后续培养过程中表现出较差的活性和分化能力。而经过40分钟ICT处理的细胞虽然在初期获得数量较多，但由于过长的冷处理时间，导致非目标细胞（如成纤维细胞）的污染，从而影响了MuSCs的纯度和分化效率。

在体外扩增过程中，研究人员采用三维培养技术，将纯化的MuSCs接种于微载体（Microcarriers, MCs）上，并在生物反应器中进行大规模培养。通过活/死细胞染色实验，发现经过30分钟ICT处理的细胞在7天的培养过程中保持了较高的存活率，并能够有效附着于微载体表面。这表明ICT方法不仅能够高效分离MuSCs，还能够为其提供一个良好的体外培养环境，使其在后续的肉制品生产中发挥重要作用。

为了进一步评估ICT处理后MuSCs的分化能力，研究人员将细胞诱导分化为肌管（myotubes），并观察其形态和功能变化。结果显示，经过30分钟ICT处理的细胞在分化过程中表现出更强的融合能力，形成更为成熟的肌管结构。而经过20分钟ICT处理的细胞则因过早发生衰老现象，导致其分化能力下降，无法继续进行有效的体外培养。相比之下，40分钟ICT处理的细胞虽然在分化初期表现出较高的MyHC表达水平，但由于成纤维细胞的污染，其分化效率在后续阶段显著降低。

在基因和蛋白表达水平上，研究人员通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot分析方法，检测了不同ICT处理时间下MuSCs的表达特征。结果表明，30分钟ICT处理的细胞在干细胞相关基因（如PAX7）和肌肉分化相关基因（如MYOD、MYOG、MyHC）的表达水平上均优于其他处理时间。尽管ICT处理后细胞的PAX7表达水平有所上升，但在诱导分化后，其MyHC表达水平却低于仅经过预贴法处理的细胞。这可能与冷处理对细胞的潜在损伤有关，包括线粒体功能受损、活性氧（ROS）积累以及脂质过氧化等现象。这些因素可能影响了细胞的分化能力，导致其在体外培养过程中表现出较低的肌肉生成潜力。

此外，研究人员还对CCM产品的物理特性进行了系统分析，包括硬度、弹性、粘附性、咀嚼性等。通过与传统猪肉丸的对比实验，发现ICT方法获得的MuSCs培养肉丸在硬度方面与传统肉丸相当，但在粘附性和咀嚼性方面略逊一筹。这主要是因为培养肉丸主要依赖淀粉作为结构支撑，而传统肉丸则含有更多的天然肌纤维结构。尽管如此，ICT方法获得的肉丸在整体质地和口感上仍具备较高的相似性，为CCM的商业化应用提供了有力支持。

本研究还探讨了ICT方法在CCM生产中的实际应用价值。传统方法如FACS和MACS虽然能够获得高纯度的MuSCs，但其操作复杂、成本高昂，且对细胞造成较大损伤，限制了其在大规模生产中的应用。相比之下，ICT方法不仅简化了操作流程，还显著降低了细胞分离和培养的成本，为CCM的工业化生产提供了更具可行性的技术路径。此外，ICT方法能够有效维持MuSCs的干细胞特性，使其在体外扩增过程中保持较高的活性和分化能力，从而提高了CCM生产的效率。

研究结果表明，30分钟ICT处理是分离猪源MuSCs的最佳时间点。该处理时间不仅能够有效减少非目标细胞的污染，还能保持MuSCs的高纯度和干细胞特性，使其在体外扩增过程中表现出最佳的增殖和分化能力。此外，ICT方法在细胞分离过程中造成的损伤相对较小，避免了传统方法对细胞功能的破坏。因此，该方法在CCM的生产过程中具有显著的优势，尤其是在细胞来源获取、培养成本控制以及生产效率提升等方面。

在实际应用中，ICT方法的简便性和经济性使其成为CCM生产的重要技术支撑。研究人员通过生物反应器实现了MuSCs的大规模三维培养，进一步验证了该方法在工业化生产中的可行性。通过将培养的细胞与淀粉混合，研究人员成功制备了具有类似传统肉丸质地的CCM产品。虽然在某些物理特性上仍存在改进空间，但ICT方法所获得的CCM产品在整体性能上已能满足市场对替代肉制品的基本要求。

从更广泛的角度来看，ICT方法的推广和应用不仅有助于降低CCM的生产成本，还能推动该技术在食品工业中的进一步发展。随着消费者对可持续食品需求的增加，CCM作为一种新兴的食品来源，正在逐步获得市场的认可。ICT方法的引入，为CCM的规模化生产提供了新的思路，同时也为其他动物源MuSCs的分离和培养提供了参考依据。

综上所述，ICT方法在分离和纯化猪源MuSCs方面展现出显著的优势。它不仅操作简便、成本低廉，还能有效保持细胞的活性和分化能力，为CCM的工业化生产奠定了坚实的基础。未来，随着技术的不断优化和推广，ICT方法有望成为CCM生产中的一种主流技术，为实现更加环保、可持续的肉类生产提供有力支持。