综述：氧气浓度对视网膜神经节细胞命运决定的影响

《Evolving Earth》：The influence of oxygen concentration on the fate determination of retinal ganglion cells

　　视网膜神经节细胞（RGCs）的发育与氧浓度动态平衡密切相关，低氧促进增殖与分化，高氧则引发氧化应激和细胞凋亡。动物模型与器官oid模型在模拟氧梯度、调控代谢及遗传编辑方面各有优劣，微流控芯片技术可精准调节氧浓度以优化RGC命运。研究揭示了HIF-1α、Notch、BDNF/TrkB等通路在氧响应中的关键作用，并指出抗氧化剂与基因编辑技术如CRISPR/Cas9可能成为治疗青光眼、早产儿视网膜病变等疾病的潜在策略。

　　本文围绕视网膜神经节细胞（RGCs）在不同氧浓度环境下的命运调控机制展开，探讨了氧气对RGCs分化、迁移、成熟及病理变化的影响，并分析了动物模型与人类类器官模型在模拟体内视网膜发育中的作用及局限性。通过综合现有研究成果，文章强调了精确调控氧气水平在研究RGCs发育过程中的重要性，并指出结合传统实验技术与新兴技术如单细胞转录组学和CRISPR/Cas9基因编辑，能够更深入地揭示RGCs命运决定的机制。

视网膜是眼球后部高度组织化的多层神经组织，其发育过程受到多种生物化学信号和机械力的调控。RGCs作为视网膜最内层的细胞，负责将视觉信息从周围感受器传递至大脑特定区域，是视觉感知的关键环节。在胚胎发育过程中，任何对RGCs分化、迁移或成熟的干扰都可能导致先天性视神经病变。近年来，研究发现氧气浓度在RGCs发育中起着至关重要的作用，其波动深刻影响RGCs的生成与命运。无论是过高的氧气浓度还是过低的氧气浓度，都会对RGCs造成损害或死亡，这与视网膜代谢环境和细胞对氧气的适应机制密切相关。此外，线粒体作为细胞的“能量工厂”，在细胞代谢中发挥核心作用，其动态变化如分裂与融合，不仅维持自身结构，还参与调控干细胞命运、保持干细胞的多能性，并促进其向其他细胞类型分化。氧气浓度的变化影响线粒体的ATP生成，同时也参与细胞信号传导和代谢调控，细胞通过调整氧气利用来适应生理条件的变化。

在视网膜发育的不同阶段，氧气浓度对RGCs命运的影响不仅限于胚胎期，还在视网膜病理中扮演重要角色。例如，在早产儿视网膜病变（ROP）中，氧气浓度的波动与异常视网膜新生血管形成密切相关。氧气缺乏会触发血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成因子的过度表达，进而导致视网膜退化。因此，探索氧气浓度如何影响RGCs命运决定的机制，不仅有助于理解视网膜发育的分子基础，也为视网膜疾病的治疗提供了潜在的靶向策略。

RGCs的分化、迁移和成熟是一个复杂的过程，受到多种因素的影响。在胚胎发育早期，RGCs起源于视网膜祖细胞（RPCs），随后迁移至视网膜神经节细胞层（GCL），并在此过程中完成成熟。迁移过程受到放射状胶质细胞的支持，并由Reelin-Dab1信号通路调控，以确保其正确定位。在GCL中，RGCs开始进行轴突形成、树突分支和突触生成，这些过程对RGCs的视觉功能至关重要。在小鼠模型中，轴突形成受到神经营养因子如神经生长因子和脑源性神经营养因子（BDNF）的引导。RGCs的轴突在胚胎期第13天首次到达视神经交叉，第14天开始跨中线迁移，并在第16.5天形成类似成年模式的交叉结构。轴突形成不仅在胚胎期持续，直到出生后第14天，RGCs才建立稳定的突触连接。在此之前，突触保持高度可塑性，使其能够适应外部视觉刺激。同时，一部分RGCs会经历程序性凋亡，以满足视网膜和视觉通路的功能需求。

在视网膜发育过程中，RGCs与RPCs之间存在反馈信号通路。例如，RGCs分泌两种相关的BMP家族分子——Gdf11和肌生成素（Gdf8），以帮助平衡RPC的增殖与RGC的生成。此外，VEGF信号通路也参与了RGC到RPC的反馈调控。RGCs作为视觉通路中的核心媒介，通过释放神经营养因子和促血管生成因子如VEGF、BDNF和胰岛素样生长因子-1（IGF-1），协调神经活动与血管生长。在ROP中，氧气浓度的异常会导致这种神经血管对话的失调，使RGCs既成为损伤的受害者，也成为其扩大的放大器。在氧气过高的阶段，RGCs会表现出过量的活性氧（ROS）、钙离子过载和早期凋亡，伴随神经营养因子分泌的显著减少。在随后的低氧阶段，VEGF的过度表达和炎症信号的激活进一步损害RGC的完整性，导致线粒体功能障碍和程序性细胞死亡。形态学上，这些病理变化表现为树突回缩、轴突无序、极性丧失和在内层视网膜中的定位错误。功能上，这些变化导致视网膜电生理反应减弱和长期视觉功能障碍，即使在部分血管恢复后仍持续存在。RGCs的丢失不仅剥夺了视网膜的神经营养支持，还加剧了血管退化，形成一个自我维持的低氧和退化循环。RGCs从代谢失衡到凋亡的转变，标志着ROP从血管发育障碍演变为慢性神经退行性疾病。因此，关注神经层面的修复对于实现早产儿视网膜的真正神经血管恢复和长期视觉功能恢复具有重要意义。

氧气浓度对RGCs生成和增殖的影响同样值得关注。在视网膜发育的不同阶段，视网膜内层和外层的氧气灌注水平存在差异。内层视网膜通常处于低氧状态，氧气分压（pO2）持续低于15 mmHg。相比之下，外层视网膜和脉络膜的氧气水平显著上升，达到约140 mmHg（18% v/v）。尽管大气中的氧气分压约为160 mmHg（21% v/v），但体外模型中RGCs所处的氧气环境可能更为复杂。氧气在培养基中的扩散需穿越3-25 mm的距离，而目标细胞仅需几微米的范围。如果细胞的氧气消耗速率超过氧气在培养基中的扩散速率，局部氧气耗竭可能导致细胞进入低氧状态，即使周围环境氧气充足。因此，理解不同氧气浓度对RGCs生成和增殖的影响，对于优化体外模型至关重要。

在体外模型中，低氧条件通常被认为有助于干细胞增殖，而高氧条件则促进分化。Albadri等的研究表明，氧气浓度可通过调节过氧化氢（H2O2）水平来调控RPCs的增殖和分化。过量的H2O2会抑制RGCs的分化，而适度的H2O2信号则促进其生成。在使用人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的类器官模型中，低氧条件被发现能增强RPCs的增殖，并上调神经视网膜（NR）标志物如SOX2，从而维持RPCs的干性并扩大其池，为后续RGC分化提供有利条件。然而，其他关于神经发育的研究显示，在2%氧气条件下，小鼠来源的神经干细胞表现出显著增强的神经分化，包括生成类似神经节的细胞。与正常氧（20%）和轻度低氧（4%）相比，2%氧气显著促进了神经细胞系的分化。这一发现挑战了传统的认知，表明在视网膜类器官模型的构建过程中，间歇性高氧暴露可能在某些情况下对RGCs发育具有积极作用。

然而，为何在体外模型中高氧暴露会产生看似矛盾的结果？本文提出了两种可能的解释。首先，视网膜类器官作为一种三维结构，其内部天然存在氧气梯度，细胞在核心区域往往暴露于慢性低氧甚至缺氧环境。间歇性高氧暴露可能通过补偿这种内部低氧，改善细胞代谢和存活率。特别是在发育后期，随着细胞密度和氧气消耗的增加，代谢需求随之上升，此时提高氧气张力有助于增强能量代谢和细胞周期进展。此外，在模拟生理氧气梯度的微流控芯片系统中，高氧区域促进外层细胞的成熟，而内层细胞则保持低氧、干细胞样状态。这种空间性氧气分布与发育阶段的耦合，解释了为何高氧条件在体外模型中能促进RGCs的分化和成熟。

其次，间歇性高氧可能引发适应性反应，刺激生长因子的表达并增强细胞迁移能力。因此，先前研究中观察到的高氧条件下RGCs分化增强，并不与早期发现相矛盾，而是反映了三维类器官中空间性氧气分布与发育阶段的耦合关系。这表明，氧气浓度的调控必须考虑其在不同发育阶段的空间分布特征，以更准确地模拟体内环境。

在低氧条件下，RGCs的迁移和成熟同样受到氧气浓度的影响。Sasaki等早期研究发现，短暂暴露于低氧条件会显著增加RGCs的细胞内钙离子（Ca2+）水平，特别是在树突区域，暗示低氧可能激活细胞反应并影响其迁移能力。在低氧条件下，RGCs通常表现出更稳定和定向的轴突生成，加强与其他视网膜细胞的连接，支持神经网络的形成，从而为RGCs的视觉功能奠定基础。此外，低氧可以通过调节细胞内离子通道活动和电生理特性，增强RGCs的兴奋性，促进其功能成熟。在类器官模型中，间歇性暴露于40%氧气显著促进了RGCs的迁移和成熟，这一现象被Tuj1阳性细胞群体所识别。基于这些发现，Gong团队开发了一种可控灌注的微流控芯片（CPMC），允许在精确调控的氧气浓度和流体剪切应力（FSS）下培养类器官。他们的研究结果表明，这种系统能够显著扩大RPC池，增强RGCs的分化、轴突生成和体外成熟，提示合适的氧气环境与生理机械信号的结合对RGCs成熟至关重要。Drabbe团队最近设计的视网膜类器官芯片（ROC）则模拟了从接近玻璃体的低氧环境（2%氧气）到接近脉络膜的高氧环境（18%氧气）的生理氧气梯度，支持RGCs的存活和成熟。与缺乏氧气梯度的常规类器官培养相比，基于梯度的系统显著提高了RGCs的存活率和成熟度。这些发现表明，维持一种生理上相关的“低氧但非缺氧”微环境有助于稳定视网膜细胞的代谢稳态和发育信号，从而促进RGCs的分化和轴突生成。

在调控RGCs命运的机制方面，氧气浓度的影响涉及多个关键信号通路和转录调控因子。RGCs在视网膜发育过程中对氧气高度敏感，氧气浓度的波动会对其分化、增殖、迁移、成熟和凋亡产生影响。这些过程受到多种信号通路和转录因子的调控。例如，高氧环境会激活内质网（ER）应激，导致ER功能受损，最终引发RGCs凋亡。高氧还会激活NADPH氧化酶4（Nox4），其活性与RGCs死亡密切相关。相比之下，Brg1/Nrf2/HO-1信号轴则提供对氧化应激的保护作用，高氧条件下Brg1上调Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1的表达，从而降低ROS水平，减少RGCs凋亡的风险。然而，长期或过度的高氧暴露会抑制Brg1的表达，削弱Nrf2/HO-1信号通路，增加RGCs的氧化应激和凋亡。

此外，高氧还会通过激活蛋白激酶R（PKR）及其下游效应器eIF2，诱导RGCs的氧化应激、炎症和凋亡。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸或PKR抑制剂C16的使用能够显著缓解这种损伤，表明该通路在调控RGCs命运方面具有重要作用。在低氧条件下，RGCs的迁移和成熟同样受到影响。Ahmad等的研究表明，在小鼠和鸡的视网膜发育早期，低氧条件会激活NF-κB，诱导神经元型一氧化氮合酶（nNOS）的表达和一氧化氮（NO）的释放，最终导致RGCs凋亡。通过NF-κB抑制剂BAY或nNOS抑制剂7-NINA，可以阻断这一过程，这些抑制剂在ROP、青光眼和糖尿病视网膜病变等疾病中具有潜在的神经保护作用。在间歇性低氧模型中，RGCs会经历ROS介导的凋亡，并表现出迁移障碍。7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）的使用可以激活Tropomyosin受体激酶B（TrkB）信号通路，包括AKT和ERK，恢复BDNF的表达，改善RGCs的迁移和存活。这些发现确认了TrkB信号通路在对抗低氧诱导的凋亡和迁移缺陷中的作用。此外，通过腺相关病毒（AAV）介导的BDNF基因传递，在青光眼动物模型中已显示出长期的神经保护效果。同时，TrkB信号通路的激动剂能够穿过血-视网膜屏障，提示其在系统性（口服）和局部给药（如眼药水或视网膜内注射）中具有应用潜力。

在探讨氧气浓度对RGCs命运调控的机制时，还需考虑不同模型的比较分析。动物模型和类器官模型在模拟体内视网膜发育时表现出不同的效果。动物模型能够保持完整的血管系统和免疫微环境，但存在物种特异性差异、复杂的遗传背景和难以精确调控局部氧气浓度的问题，这限制了其在临床转化中的应用。相比之下，类器官模型能够建立可控的氧气环境，并模拟人类特异性的视网膜发育，因此更适用于机制研究和临床前治疗筛选。然而，类器官模型缺乏血管系统和完整的神经连接，导致RGCs往往难以长期存活。为了解决这一问题，许多研究团队开始探索将血管和免疫成分整合进类器官系统。最近的研究已成功实现血管类器官与视网膜类器官的共培养，形成穿透类器官核心的血管样管状结构。这种血管网络不仅缓解了由于营养和氧气扩散受限导致的中心细胞死亡，还促进了废物清除、代谢稳态维持和视网膜神经元的分化。此外，血管化的类器官模型能够更好地模拟体内微环境，为研究与血管相关的视网膜疾病如ROP和糖尿病视网膜病变提供更高的生理相关性。尽管免疫相关的类器官研究仍处于初步阶段，但通过分离诱导干细胞并随后在共培养系统中整合，研究人员已成功建立功能性的微胶质细胞迁移至外丛状层的模型。功能评估进一步显示，与类器官共培养的微胶质细胞在受到外部刺激时表现出增强的激活反应，提示其在模拟视网膜微环境中的神经免疫相互作用方面具有潜力。

为了进一步提升类器官模型的临床转化潜力，许多研究团队正在采用跨学科策略优化类器官培养系统。3D生物打印和微流控技术的结合正在被广泛应用于重建循环样结构，并研究在视网膜类器官模型中营养和氧气的精确输送。例如，CPMC系统通过微流控技术构建的类器官具有连续灌注的小室，使3D类器官能够模拟组织和器官的生理结构。这种系统的优势在于其能够精确调控流体剪切应力和氧气分布，从而促进RGCs的轴突生成和功能成熟，同时不干扰类器官早期发育中的空间和时间事件。Drabbe团队设计的ROC系统则维持了一种生理相关的氧气梯度，促进类器官中内外层视网膜细胞的表型成熟。与静态对照或缺乏氧气梯度的ROC相比，主动灌注和稳定的氧气梯度成功诱导了更高RGCs活力。

未来的研究应聚焦于动物模型和类器官模型的双重比较研究，结合两者的优势，逐步优化以复制人类视网膜的原生微环境，从而提升实验结果的转化潜力。目前，动物模型在研究视网膜发育过程中具有较高的准确性，能够全面反映氧气、血管、炎症和代谢因素之间的交互作用，适合于系统层面的验证。然而，其存在的物种特异性差异、复杂的遗传背景和难以精确调控局部氧气浓度的问题，限制了其在临床转化中的应用。相比之下，类器官模型在机制研究和临床前治疗筛选方面展现出更大的潜力，能够模拟人类特异性的视网膜发育过程。然而，类器官模型在血管系统和完整神经连接方面的缺失，仍然是其在研究RGCs与中间神经元相互作用时的挑战。因此，未来的研究需要开发新的技术手段，以支持类器官中RGCs的长期存活。

此外，研究团队已经开始探索将血管和免疫成分整合进类器官系统。最近的研究成功实现了血管类器官（由内皮细胞和周细胞组成）与视网膜类器官的共培养，形成了穿透类器官核心的血管样管状结构。这种血管网络不仅缓解了由于营养和氧气扩散受限导致的中心细胞死亡，还促进了废物清除、代谢稳态维持和视网膜神经元的分化。此外，血管化的类器官模型能够更好地模拟体内微环境，为研究与血管相关的视网膜疾病如ROP和糖尿病视网膜病变提供更高的生理相关性。尽管免疫相关的类器官研究仍处于初步阶段，但通过分离诱导干细胞并随后在共培养系统中整合，研究人员已成功建立功能性的微胶质细胞迁移至外丛状层的模型。功能评估进一步显示，与类器官共培养的微胶质细胞在受到外部刺激时表现出增强的激活反应，提示其在模拟视网膜微环境中的神经免疫相互作用方面具有潜力。

为了进一步提升类器官模型的临床转化潜力，许多研究团队正在采用跨学科策略优化类器官培养系统。3D生物打印和微流控技术的结合正在被广泛应用于重建循环样结构，并研究在视网膜类器官模型中营养和氧气的精确输送。例如，CPMC系统通过微流控技术构建的类器官具有连续灌注的小室，使3D类器官能够模拟组织和器官的生理结构。这种系统的优势在于其能够精确调控流体剪切应力和氧气分布，从而促进RGCs的轴突生成和功能成熟，同时不干扰类器官早期发育中的空间和时间事件。Drabbe团队设计的ROC系统则维持了一种生理相关的氧气梯度，促进类器官中内外层视网膜细胞的表型成熟。与静态对照或缺乏氧气梯度的ROC相比，主动灌注和稳定的氧气梯度成功诱导了更高RGCs活力。

综上所述，动物模型和类器官模型在视网膜发育研究中各具优势，也存在局限。动物模型能够更准确地反映氧气、血管、炎症和代谢因素之间的交互作用，适用于系统层面的验证，但在临床转化方面存在挑战。类器官模型则能够建立可控的氧气环境，并模拟人类特异性的视网膜发育，因此更适用于机制研究和临床前治疗筛选。然而，类器官模型在血管系统和完整神经连接方面的缺失，仍然是其在研究RGCs与中间神经元相互作用时的障碍。因此，未来的研究需要开发新的技术手段，以支持类器官中RGCs的长期存活。随着研究的深入，这些模型将为视网膜疾病的治疗提供更加精确和有效的平台，从而推动相关领域的进步。