通过核磁共振（NMR）技术在溶液中观察人类P物质与G蛋白偶联受体NK1R的相互作用

《Journal of the American Chemical Society》：Human Substance P Interactions with G Protein-Coupled Receptor NK1R Observed by NMR in Solution

　　SP与NK1R结合中N端柔性及C端刚性锚定的结构生物学研究及功能影响分析，

　　物质P（Substance P，简称SP）是一种重要的神经肽，自1931年被首次描述以来，因其在多种生理过程中的作用而受到广泛关注。SP主要通过与神经激肽1受体（Neurokinin 1 receptor，NK1R）结合，参与调控恶心、炎症、神经疾病等关键功能。NK1R属于类A G蛋白偶联受体（GPCR）家族，广泛分布于神经系统中，并在多种病理条件下成为潜在的治疗靶点。尽管SP的结构和功能已被广泛研究，但以往的结构测定技术，如冷冻电子显微镜（cryo-EM）和X射线晶体学，往往未能清晰解析SP与NK1R的N端肽段的相互作用。因此，研究人员通过结合氟-19核磁共振（¹⁹F-NMR）光谱技术和功能实验，进一步揭示了这些N端肽段在SP与NK1R结合过程中的作用机制。

SP的序列是RPKPQQFFGLM-NH₂，其中C端为酰胺化结构。为了研究N端肽段对SP-NK1R相互作用的影响，研究人员在SP的不同位置引入了¹⁹F标记的探针——3-三氟甲基-L-苯丙氨酸（mtfF），并使用溶液核磁共振技术分析其在水溶液中、与LMNG/CHS微胶束结合时以及与微胶束溶解的NK1R结合时的动态行为。实验结果显示，SP的N端五肽段在与NK1R结合时表现出高度的灵活性和溶剂暴露特性，而C端六肽段则被稳定地锚定在NK1R的正构结合口袋中。这一发现表明，SP的N端肽段在结合过程中可能具有重要的动态功能，其结构变化可能影响受体激活的效率和信号传导的路径。

为了进一步验证这些动态变化对SP功能的影响，研究人员进行了环腺苷酸（cAMP）积累功能实验。实验结果显示，当SP的K3和Q5残基被¹⁹F探针取代后，其生物活性显著降低，而结合亲和力并未明显变化。这表明，K3和Q5的侧链与NK1R的某些结合位点之间的瞬时相互作用可能对SP的生物功能起着关键作用。此外，实验还发现，C端截断的SP7f[6–11]在激活G_q信号通路时表现出更高的偏好性，这进一步支持了SP长度和动态特性对信号传导路径选择的重要性。

在实验过程中，研究人员使用了多种技术手段来确保数据的准确性和可靠性。首先，通过¹⁹F-NMR技术，他们能够观察到SP在不同结合状态下的信号变化。例如，在NK1R结合状态下，SP的N端五肽段表现出较为尖锐的信号，而在与微胶束非特异性结合时，其信号则变得更为宽泛。这种信号差异反映了N端肽段在结合过程中可能经历的构象变化，以及其在受体结合口袋中的动态行为。此外，通过饱和转移实验（saturation transfer experiments）和二维交换光谱（EXSY）实验，研究人员进一步确认了SP在不同结合状态之间的交换速率，并揭示了其在受体结合和非特异性结合状态之间的动态平衡。

为了获得SP与NK1R结合的更详细信息，研究人员还使用了均匀¹⁵N和¹³C标记的SP进行核磁共振实验。实验结果显示，当SP与NK1R结合时，其信号主要来自于“自由”状态，即未结合受体的部分。这表明，在实验条件下，SP与NK1R的结合非常紧密，几乎所有的SP都处于受体结合状态。同时，实验还发现，当加入不同浓度的空微胶束时，SP的信号并未发生显著变化，这进一步支持了SP在与NK1R结合时的动态行为。

在讨论部分，研究人员分析了SP与NK1R结合过程中可能的动态机制。例如，SP的N端五肽段在与NK1R结合时表现出较高的灵活性，这可能与其在受体结合口袋中的动态构象有关。而C端六肽段则被稳定地锚定在正构结合口袋中，这可能与其结构的刚性有关。此外，研究人员还探讨了SP与NK1R结合过程中可能的Xxx-Pro肽键异构化现象。这一现象在NMR数据中表现为信号的宽化和化学位移的变化，进一步说明了SP在结合过程中可能经历的构象变化。

实验还发现，当使用不同的拮抗剂进行竞争实验时，SP与NK1R的结合可以被有效地逆转。例如，CP99994和aprepitant这两种拮抗剂能够显著减少SP在NK1R上的结合，这表明SP与NK1R的结合具有一定的可逆性。这一结果对于理解SP与NK1R的动态相互作用具有重要意义，因为可逆结合可能意味着SP在细胞内可以被快速代谢或被其他分子取代，从而影响其生物活性。

此外，研究人员还通过比较不同SP变体的结合情况，揭示了N端肽段在SP-NK1R相互作用中的关键作用。例如，当SP的N端五肽段被截断后，其结合亲和力显著下降，这与文献中报道的SP代谢产物对信号传导的影响一致。这一结果表明，SP的N端肽段可能在调控其与NK1R的结合亲和力和生物活性方面起着重要作用。同时，实验还发现，SP的C端截断变体SP7f–OH在与NK1R结合时完全失去了生物活性，这进一步支持了C端结构在SP功能中的重要性。

研究还涉及了NK1R的结构和功能特性。例如，NK1R的ECL2区域中存在一个带正电荷的残基R177，该残基可能与SP的N端肽段发生相互作用，从而影响SP的结合和激活效率。此外，研究还发现，SP的N端肽段在与NK1R结合时表现出动态特性，这可能与其在受体结合口袋中的暴露程度有关。而C端肽段则被稳定地锚定在正构结合口袋中，这可能与其结构的刚性有关。

综上所述，该研究通过结合¹⁹F-NMR技术和功能实验，深入探讨了SP与NK1R的相互作用机制。研究结果表明，SP的N端肽段在结合过程中表现出高度的灵活性和溶剂暴露特性，而C端肽段则被稳定地锚定在受体的正构结合口袋中。这些动态特性可能对SP的生物活性和信号传导路径产生重要影响。此外，研究还发现，SP的N端肽段在与NK1R结合时可能经历瞬时相互作用，这些相互作用可能对SP的结合亲和力和功能产生显著影响。通过这些研究，研究人员为理解SP-NK1R的动态相互作用提供了新的视角，并为相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。