橄榄苦苷非糖苷部分调节人类骨骼肌细胞中的氧化应激和自噬相关通路

《BioFactors》：Oleuropein Aglycone Modulates Oxidative Stress and Autophagy-Related Pathways in Human Skeletal Muscle Cells

　　肌肉萎缩症（sarcopenia）的氧化应激和自噬机制研究。oleuropein aglycone通过激活AMPK/FOXO3a通路抑制活性氧（ROS）生成，减少SA-β-gal染色阳性细胞比例，上调NRF2、PPARGC1A及SESNs等抗氧化相关基因表达，并诱导自噬体形成。实验采用AB1079人肌细胞模型，证实25μM OLE预处理可显著降低300μM H2O2诱导的氧化损伤和衰老标志物。该研究为天然产物防治肌肉衰老提供了分子机制依据，但需进一步体内验证。

　　肌肉质量与力量的逐渐丧失，会显著增加跌倒、虚弱和死亡的风险。这一现象通常是由多种内在和外在因素共同作用的结果。内在因素包括氧化应激、线粒体功能障碍等，而外在因素则包括营养不良、缺乏运动等。研究发现，一种从橄榄叶中提取的化合物——橄榄苦苷（OLE）能够通过其抗氧化和诱导自噬的特性对抗氧化损伤。OLE可以激活AMPK和FOXO3a信号通路，促进自噬作用、线粒体功能和肌肉健康。本研究通过在人类永生肌原细胞系AB1079中进行实验，评估OLE对肌肉氧化应激的保护作用。实验结果显示，通过氢过氧化物（H?O?）诱导氧化应激后，OLE预处理可显著降低细胞内活性氧（ROS）的生成，约为43%。此外，H?O?处理后，细胞中出现33%的衰老细胞，而OLE预处理则能显著减少X-gal反应的染色面积，约为12%。OLE不仅增加了与抗氧化防御相关的基因表达，还通过诱导AMPK的振荡磷酸化，影响自噬过程和代谢调节因子SESN2和SESN3的表达。这些发现表明，OLE可能在对抗与肌肉衰老相关的细胞机制中发挥重要作用，但仍需进一步的体内研究来确认其抗衰老效果。

在老年人中，肌肉质量与力量的逐渐下降通常与慢性的肌肉疾病有关，这种疾病会伴随骨骼肌系统的功能衰退，从而增加老年人跌倒和骨折的风险，同时也会导致肥胖、虚弱、住院率和死亡率的上升。肌肉衰弱或肌肉减少症（sarcopenia）的定义因多因素影响而具有挑战性。内在因素包括促炎性细胞因子的释放、氧化应激和线粒体功能的下降，而外在因素如营养状况、药物使用和缺乏运动等，都会在复杂的动态关系中影响肌肉减少症的发展与进展。因此，理解可能影响衰老和相关病理变化的细胞通路至关重要。

在肌肉收缩过程中，大量ROS被产生，这使得骨骼肌更容易受到氧化应激和细胞衰老的影响。在老年人中，假设肌肉衰老或疾病与高ROS水平和收缩功能障碍有关，这可能是由于慢性肌肉不活动所致。事实上，观察到在静止状态下，与年轻小鼠相比，老年小鼠分离的骨骼肌纤维中内源性氧化物的产量增加。有大量证据表明，氧化损伤在衰老过程中起重要作用，并导致肌肉功能的退化。这促使了对抗氧化剂作为潜在治疗手段的广泛研究。橄榄苦苷是一种从橄榄叶中提取的生物活性酚类化合物，因其抗氧化和抗炎特性而广为人知。这种天然化合物的药理特性主要归因于其强大的抗氧化活性，这源于其通过分子内羟基与酚氧自由基形成氢键的能力来中和自由基的反应性。有趣的是，橄榄苦苷可以在预防性和干预性层面发挥抗氧化作用。动物和细胞培养研究显示，橄榄苦苷苷元（OLE）通过激活5′-AMP-activated蛋白激酶（AMPK）和表达与自噬调控相关的机械靶点（mTOR）蛋白以及转录因子Forkhead box O3A（FOXO3a）来增强自噬反应。在应激条件下，AMPK通过抑制mTORC1或激活ULK1进行磷酸化来启动自噬。事实上，高mTORC1活性已被证明会导致老年小鼠和人类骨骼肌纤维的损伤。此外，AMPK可以直接磷酸化转录因子FOXO3a（在Ser413位点），从而增加其活性并促进其核转位。在核水平上，FOXO3a通过开启支持细胞抗氧化防御策略的目标基因来切换，这些基因可以防止ROS的形成，清除已经形成的ROS（如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶），并通过刺激激活保护性反应的信号通路来促进对氧化环境的适应。此外，FOXO3a激活诸如过氧化物酶增殖物激活受体γ共激活因子1α（PPARGC1A）等基因，从而形成一个反馈环路，改善线粒体功能和抗氧化能力，以及编码如sestrins等蛋白的基因，这些蛋白参与抗氧化反应、自噬和与年龄相关的疾病。有趣的是，FOXO依赖的sestrin 3的产生已被证明可以抑制mTOR复合体1。

相反，蛋白激酶B（Akt）对FOXO3a的拮抗调控，响应于胰岛素/生长因子的刺激，会导致FOXO的直接磷酸化，从而被转移到细胞质并失活。在本研究中，我们评估了OLE对氧化应激反应和自噬的影响，特别是在人类肌原细胞模型AB1079中。这些发现仅限于体外系统，需要进一步的体内研究来确定这些机制是否在整体水平上转化为功能性抗衰老效果。

研究采用的化学物质和试剂包括OLE，其从CliniSciences Group（法国）购买，并储存在DMSO（EuroClone S.p.A., 意大利）中。雷帕霉素和荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）从Sigma-Aldrich（Merck KGaA, 德国）获得。Geltrex溶液从Life Technologies（Thermo Fisher Scientific Inc., 美国）购买。这些化学物质和试剂用于细胞培养和处理，以确保实验的准确性和可重复性。

细胞培养和处理过程涉及使用永生肌原细胞系，这些细胞是研究骨骼肌的重要工具，并被用作各种基础研究中的治疗相关模型。人类永生肌原细胞系AB1079从巴黎的Institut de Myologie的MyoLine永生化平台获得。这些细胞来源于一名38岁健康男性的股四头肌活检，由EuroBioBank Myobank-AFM提供，并在获得知情同意后，经过匿名化处理，按照欧盟GDPR规定进行永生化。细胞的永生化使用了hTERT/cdk4方法，如Mamchaoui等人所述。

细胞培养的生长培养基由199培养基和DMEM高葡萄糖培养基组成，比例为1:4，并补充了20% FBS、50 μg/mL庆大霉素、25 μg/mL牛胎球蛋白、5 ng/mL hEGF、0.5 ng/mL bFGF、0.2 μg/mL地塞米松和5 μg/mL人胰岛素。细胞被接种在Geltrex包被的支持物上，并在37°C、5% CO?的湿度环境中培养。在细胞融合度达到80%时，通过替换生长培养基为DMEM高葡萄糖培养基并补充50 μg/mL庆大霉素和10 μg/mL胰岛素，诱导分化过程持续7天。为了确定在实验设计中使用OLE的最佳浓度，不损害细胞活力，细胞被用不同浓度的OLE（10、25或50 μM）和H?O?（50、100、200或300 μM）处理。车辆（0.05% DMSO）作为对照。在实验设计中，AB1079细胞被预处理24小时，随后暴露于H?O?以促进应激诱导的早期衰老，并观察OLE的预防作用。

为了检测自噬，细胞被用500 nM雷帕霉素处理，作为自噬诱导的正向对照。实验中，细胞被接种在Geltrex包被的μ-slide八孔ibiTreat室中，并在分化7天后进行处理。雷帕霉素处理作为自噬诱导的正向对照。处理后，细胞被用PBS洗涤并按照制造商的协议进行染色。随后，染色的细胞被用4%多聚甲醛（PFA）溶液固定15分钟。图像通过配备EC-PLAN Neofluar 20×/0.50 M27物镜和Infinity Color Corrected System的Axio Observer Z1荧光显微镜获取。滤光片设置为470/525 nm用于荧光探针，以可视化自噬泡，390/460 nm用于 Hoechst 33258 染色，以可视化细胞核。自噬泡的数量通过ImageJ 1.53r软件进行计数，自噬诱导的增加体现在自噬泡数量的增加上。

细胞活力检测使用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑盐）实验进行。AB1079细胞在Geltrex包被的96孔板中培养7天，并按照实验方案进行处理。处理后，细胞被用PBS洗涤，并在37°C下与5 mg/mL MTT孵育4小时。生成的formazan被溶解在DMSO中，并在37°C下孵育过夜。使用Spark微板读数器在570 nm波长下测量吸光度。

为了评估细胞衰老和抗衰老效果，使用了SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色测试。蓝色染色细胞的存在表示衰老细胞。AB1079细胞被接种在Geltrex包被的μ-slide八孔ibiTreat室中，密度为6×10?个细胞/孔，分化7天后按照实验方案进行处理。处理后，细胞被用4% PFA溶液固定15分钟。染色图像通过配备EC-PLAN Neofluar 20×/0.50 M27物镜和Infinity Color Corrected System的Axio Observer Z1显微镜获取。蓝色染色面积通过ImageJ 1.53r软件计算。

为了提取AB1079细胞培养物中的RNA，去除培养基后，向培养皿中加入0.1 mL/cm2 TRIzol试剂。样品被收集并使用PureLink RNA Mini Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）按照制造商说明提取RNA。使用Spark微板读数器的酸性核苷酸定量工具测量RNA浓度。RNA样品的纯度范围在1.8至1.9之间。

Primer3 Input软件用于设计与抗氧化防御相关的基因引物，包括sestrin 1（SESN1）、sestrin 2（SESN2）、sestrin 3（SESN3）、核因子erythroid 2相关因子2（NRF2）、过氧化物酶增殖物激活受体γ共激活因子1α（PPARGC1A）和超氧化物歧化酶2（SOD2）。基因银行编号、引物组、产物长度和相对退火温度列于表1中，根据HUGO基因命名委员会的命名标准。

总RNA通过ImProm-II逆转录系统（Promega）在MJ热循环仪上进行逆转录。实时PCR分析在每个处理中进行三次，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG反应试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.）进行。对于每种基因，将cDNA样品池进行分析，并使用连续稀释的池来优化实时PCR条件，包括cDNA和引物浓度，计算效率、荧光基线和阈值。PCR扩增通过在96孔荧光热循环仪上进行40次循环（10秒在95°C，30秒在特定退火温度，30秒在72°C）完成。在每次PCR反应后，分析扩增产物的熔解曲线，以确认是否检测到单一的PCR产物。

目标基因表达通过β-actin（ACTB）和β-2-微球蛋白（B2M）mRNA的几何平均值进行归一化，并分析为处理（H?O?、OLE和OLE+H?O?）相对于车辆的相对倍数变化。

为了评估自噬的诱导，使用了Cyto-ID自噬检测试剂盒2.0（Enzo Life Science），其中包含一种荧光探针，标记自噬过程中的囊泡。AB1079细胞被接种在μ-slide 8孔ibiTreat室中，分化7天后按照实验方案处理。雷帕霉素处理作为自噬诱导的正向对照。处理后，细胞被用PBS洗涤并按照制造商的协议进行染色。随后，染色的细胞被用4% PFA溶液固定15分钟。图像通过配备EC-PLAN Neofluar 40×/0.75 M27物镜和Infinity Color Corrected System（ICS）的Axio Observer Z1荧光显微镜获取。滤光片设置为470/525 nm用于荧光探针，以可视化自噬囊泡，390/460 nm用于Hoechst 33258染色，以可视化细胞核。自噬囊泡的数量通过ImageJ 1.53r软件进行计数。自噬诱导的增加体现在自噬囊泡数量的增加上。

为了验证OLE诱导自噬的能力，还检测了自噬标志物LC3蛋白的表达。LC3B-II与LC3B-I的比值在OLE单独处理和预处理细胞中显著高于车辆和H?O?处理的细胞。这一现象表明，OLE显著增加了自噬活性。此外，研究还分析了自噬相关蛋白p62和其在Ser403位点的磷酸化形式。结果显示，OLE处理的细胞和预处理后暴露于H?O?的细胞中，p62的水平显著增加，而雷帕霉素处理的细胞中p62水平显著下降，表明自噬通路的完成。

在研究中，还观察了AMPKα在OLE诱导自噬过程中的磷酸化水平。在OLE处理的细胞中，AMPKα在Thr172位点的磷酸化水平显著低于车辆和H?O?处理的细胞。这表明，OLE可能通过激活AMPK来促进自噬，但其作用具有时间依赖性。在不同时间点进行的处理显示，OLE处理后20分钟，AMPKα的磷酸化水平显著增加，而在24小时处理后，磷酸化水平显著下降。这一结果表明，OLE可能通过激活AMPK在短时间内促进自噬，但在长期处理中其效果减弱。

此外，研究还分析了FOXO3a的磷酸化水平，这在OLE处理的细胞中有所变化。FOXO3a在不同特定位点的磷酸化水平控制其亚细胞定位和转录活性。AMPK可以磷酸化FOXO3a在Ser413位点，从而增加其转录活性，而PKB/AKT对FOXO3a在Ser253位点的磷酸化则导致其从细胞核中排除，并与14-3-3蛋白结合，从而抑制其转录活性。研究显示，OLE处理的细胞中，FOXO3a在Ser413位点的磷酸化水平有所增加，而在Ser253位点的磷酸化水平则有所下降，这与H?O?处理的细胞中观察到的模式一致。

综上所述，本研究通过体外实验系统，探讨了OLE在对抗肌肉氧化应激和促进自噬中的作用。结果表明，OLE能够显著降低ROS的生成，减少细胞衰老的迹象，并增强与抗氧化防御和自噬相关的基因表达。这些发现为未来研究OLE在抗衰老和肌肉健康方面的潜力提供了基础，但仍需进一步的体内实验来验证其在生物体内的实际效果。此外，研究还强调了AMPK在调控自噬和FOXO3a活性中的关键作用，以及这些信号通路在维持细胞稳态中的重要性。未来的研究应关注生理浓度、代谢产物和体内模型，以更全面地评估OLE的抗衰老潜力。