KDM5A介导的H3K4me3去甲基化缺失通过激活Wnt/β-catenin通路促进神经发育异常

《Cell Death & Disease》：Loss of KDM5A-mediated H3K4me3 demethylation promotes aberrant neural development by Wnt/β-catenin pathway activation

　　本研究针对叶酸缺乏导致神经管缺陷（NTDs）的分子机制尚不明确的难题，揭示了组蛋白去甲基酶KDM5A下调是叶酸缺乏诱发NTDs的关键环节。研究人员发现叶酸缺乏通过下调转录因子PAX2，导致KDM5A表达降低，进而引起Wnt/β-catenin信号通路关键基因启动子区H3K4me3水平升高，通路异常激活，最终导致神经管发育异常。该研究不仅阐明了叶酸预防NTDs的表观遗传新机制，也为相关先天畸形的诊断和防治提供了潜在靶点。

　　

每一个新生命的孕育都如同一场精密的交响乐，而神经管的正常闭合则是这首乐章中至关重要的序曲。神经管缺陷（Neural Tube Defects, NTDs）是一类严重的出生缺陷，源于胚胎早期神经管闭合失败。令人欣慰的是，孕期补充叶酸已被证实能有效预防30-70%的NTDs发生，然而，这背后神奇的“守护”机制究竟是什么，科学界至今未能完全阐明。就像知道一把钥匙能开门，却不太清楚锁芯内部是如何工作的。以往的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活会导致胚胎前后轴模式化缺陷，进而引发NTDs，但表观遗传因素是否以及如何参与这一过程，仍是一个待解的谜题。

近日，发表在《Cell Death & Disease》上的一项研究，如同一位细心的侦探，深入探索了叶酸、表观遗传修饰与神经发育之间的内在联系，为我们揭开了这层神秘面纱的一角。该研究团队发现，在叶酸缺乏的情况下，一种名为KDM5A的组蛋白去甲基酶表达量下降，导致其负责“擦除”的基因激活标记——组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）在Wnt/β-catenin信号通路多个关键基因的启动子区异常堆积。这些堆积的H3K4me3标记如同打开了基因表达的“开关”，使得Wnt/β-catenin通路过度活跃，最终扰乱了正常的神经管发育程序，导致NTDs的发生。更重要的是，研究人员还追根溯源，发现叶酸缺乏会通过降低另一个关键因子PAX2的表达，进而影响KDM5A的转录。这项研究不仅为理解叶酸预防NTDs的机制提供了全新的表观遗传视角，也指出了KDM5A和PAX2作为潜在干预靶点的重要性。

为了深入探究这一机制，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在细胞模型方面，他们培养了叶酸缺乏的小鼠胚胎干细胞（mESCs）、NE4C细胞和HEK293T细胞，并诱导mESCs分化为神经祖细胞（NPSCs）。在动物模型上，他们成功构建了叶酸缺乏诱导的小鼠NTDs模型，并利用斑马鱼胚胎进行基因功能验证。在分子机制探索中，研究采用了染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和切割标签技术（Cut&Tag）在全基因组范围内分析H3K4me3的分布；通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光染色检测基因和蛋白表达水平；利用荧光素酶报告基因实验验证转录因子与启动子的结合；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KDM5A敲除细胞系；借助全胚胎培养（WEC）系统和显微注射技术研究KDM5A在体功能；并对临床收集的人类NTDs胎儿脑组织样本进行了NanoString基因表达分析。这些多层次、多物种的研究策略为结论的可靠性提供了坚实支撑。

H3K4甲基化与叶酸缺乏下Wnt/β-catenin靶基因上调相关

研究人员首先在叶酸缺乏培养的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中进行了H3K4me3的ChIP-seq分析。虽然全基因组水平的H3K4me3信号没有显著差异，但对差异甲基化峰值的富集分析发现，Wnt/β-catenin信号通路是其中最富集的通路之一。基因本体（GO）富集分析也显示，这些差异甲基化基因显著富集于胚胎发育和神经发生相关功能。ChIP-qPCR结果进一步证实，在叶酸缺乏的mESCs和NE4C细胞中，多个神经发育相关的Wnt靶基因（如Axin2, Bcl9l, Atoh1, Nkx2.2, Sox1, Isll）的启动子区H3K4me3水平显著升高，且这些基因的mRNA表达也相应上调，并可被补充叶酸所逆转。这表明叶酸缺乏可能通过增加特定基因启动子区的H3K4me3修饰来激活其转录。

叶酸缺乏背景下KDM5A表达降低是Wnt/β-catenin靶基因H3K4me3修饰的原因

那么，是什么导致了H3K4me3水平的升高呢？研究人员将目光投向了负责去除H3K4me3修饰的组蛋白去甲基酶。蛋白质印迹分析显示，在叶酸缺乏的细胞中，KDM5A的蛋白水平显著下降，而其同源蛋白KDM5B则无明显变化。同时，H3K4me3的整体水平升高。在NE4C细胞中，过表达KDM5A可以逆转叶酸缺乏引起的Wnt靶基因表达上调和其启动子区H3K4me3水平的升高；相反，敲低KDM5A则能模拟叶酸缺乏的效果，即使在不缺叶酸的条件下也能激活Wnt靶基因并增加其H3K4me3修饰。这些结果在HEK293T细胞中也得到了验证。这表明KDM5A是叶酸缺乏条件下调控H3K4me3水平和Wnt靶基因表达的关键分子。

KDM5A缺失与叶酸剥夺扰乱神经发育调控因子的H3K4me3景观

为了更深入地了解KDM5A缺失的影响，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了KDM5A敲除（KO）的HEK293T细胞系。与预期一致，KDM5A-KO细胞中H3K4me3水平升高，并且TOPFlash/FOPFlash荧光素酶报告基因实验证实Wnt/β-catenin通路的转录活性显著增强。通过Cut&Tag技术对KDM5A-KO细胞进行全基因组H3K4me3分布分析，GO和KEGG通路富集分析均显示，H3K4me3富集的基因与神经系统发育、Wnt信号通路等密切相关。此外，在叶酸缺乏条件下由mESCs分化而来的神经祖细胞（NPSCs）中，Cut&Tag分析也揭示了H3K4me3在全基因组转录起始位点（TSS）的广泛增加，并且这些差异峰同样富集于Wnt信号通路和神经发育相关基因。ChIP-qPCR再次确认了叶酸缺乏的NPSCs中Wnt靶基因启动子区H3K4me3修饰的增强。这些结果表明，KDM5A的缺失和叶酸缺乏共同破坏了神经发育过程中的表观遗传景观。

低水平的去甲基酶KDM5A导致NTDs动物模型中的神经发育异常

研究进一步在动物体内验证上述发现。在叶酸缺乏诱导的小鼠NTDs模型中，E9.5天胚胎表现出严重的脊柱裂和無脑畸形。免疫荧光染色显示，NTDs模型鼠神经管组织中KDM5A蛋白减少，而H3K4me3信号增强。RT-qPCR分析发现，NTDs模型鼠胚胎脑和脊柱组织中多个Wnt靶基因的mRNA表达上调，而Kdm5a mRNA表达下调。ChIP-qPCR证实了NTDs模型鼠脑组织中Wnt靶基因启动子区H3K4me3富集程度更高。蛋白质印迹分析也一致显示，NTDs模型鼠脑和脊柱组织中KDM5A蛋白水平下降，H3K4me3水平上升。对E9.5天NTDs模型鼠脑组织进行的H3K4me3 Cut&Tag分析显示，增加的H3K4me3峰值富集的基因主要与系统发育和胚胎发育相关。这些体内实验数据有力地支持了KDM5A低表达通过升高H3K4me3水平激活Wnt靶基因表达，从而导致NTDs的结论。

KDM5A敲低损害胚胎脑神经发育

为了直接证明KDM5A在神经管闭合中的作用，研究人员通过显微注射将靶向Kdm5a的短发夹RNA（shRNA）慢病毒导入E8.5天的小鼠胚胎，然后利用全胚胎培养（WEC）系统继续培养至相当于E10.5天。结果显示，与注射对照慢病毒的胚胎相比，注射sh-KDM5A慢病毒的胚胎出现了严重的发育延迟和缺陷，包括大脑发育异常和神经管未闭合。形态学评分显示，sh-KDM5A组胚胎的神经管等多个系统发育指标得分显著降低。RT-qPCR分析证实，敲低KDM5A后，胚胎脑中Wnt靶基因表达上调，ChIP-qPCR也显示这些基因启动子区的H3K4me3水平升高。此外，在斑马鱼胚胎中利用CRISPR/Cas9敲低KDM5A，也导致了类似NTDs的表型，如体轴弯曲和头部变小。RNA-seq和RT-qPCR分析均表明，KDM5A敲低的斑马鱼胚胎中Wnt靶基因表达上调，原位杂交（ISH）进一步在形态上验证了几个关键基因的表达增加。这些功能获得和功能缺失实验从正反两方面证实了KDM5A在正常神经发育中的不可或缺的作用。

PAX2在叶酸缺乏背景下调控KDM5A转录

机制研究继续向前追溯：叶酸缺乏是如何导致KDM5A表达下降的？通过生物信息学分析，研究人员在Kdm5a启动子区上游1 kb内发现了TCF12、PAX2和LEF1等转录因子的结合基序。在NTDs模型鼠的脑和脊柱组织中，这三个基因的mRNA表达均下调。荧光素酶报告基因实验表明，只有过表达PAX2能显著激活由KDM5A启动子驱动的荧光素酶活性。ChIP-qPCR实验证实，PAX2能直接结合到Kdm5a的启动子区，并且这种结合在叶酸缺乏的NE4C细胞中减弱。蛋白质印迹显示叶酸缺乏的NE4C细胞中PAX2蛋白水平降低。在NE4C细胞中敲低Pax2，会导致Kdm5a的mRNA表达显著下降，免疫荧光染色也观察到PAX2和KDM5A蛋白水平的同步降低。在NTDs模型鼠的神经管组织中，免疫荧光染色同样检测到PAX2和KDM5A蛋白的共减少。更有趣的是，研究人员在叶酸缺乏的NPSCs中发现了Pax2启动子区的H3K4me3水平降低，ChIP-qPCR证实了这一发现，并且补充叶酸可以恢复Pax2启动子区的H3K4me3修饰和PAX2的蛋白表达。这揭示了一个更为精细的调控环路：叶酸缺乏通过降低Pax2启动子区的H3K4me3水平，抑制PAX2的表达，进而减少其对Kdm5a的转录激活，最终导致KDM5A表达下调。

NTDs样本中KDM5A mRNA表达降低与Wnt靶基因表达升高相关

最后，研究回归临床，验证上述发现在人类NTDs中的相关性。对20对低叶酸NTDs胎儿和对照胎儿脑组织的NanoString分析显示，所有六个选定的Wnt/β-catenin通路靶基因（AXIN2, ATOH1, BCL9L, ISL1, SOX1, NKX2.2）的mRNA表达在NTDs样本中均显著上调。在9对样本中，NTDs组的KDM5A mRNA表达显著低于对照组。相关性分析表明，KDM5A的mRNA表达水平与每个Wnt靶基因的表达均呈显著负相关，并且与脑组织中的叶酸浓度呈显著正相关。蛋白质印迹分析进一步发现，9例無脑畸形患者脑组织中的H3K4me3蛋白水平高于年龄和性别匹配的对照样本。这些临床数据有力地支持了动物和细胞实验的结论，表明KDM5A-H3K4me3-Wnt/β-catenin轴在人类叶酸敏感性NTDs的发生中同样扮演着重要角色。

综上所述，这项研究系统地阐明了叶酸缺乏导致神经管缺陷的一条新颖的表观遗传学通路：母体叶酸缺乏→（通过H3K4me3修饰？）→PAX2表达下调→KDM5A转录抑制→H3K4me3去甲基化作用减弱→Wnt/β-catenin通路关键基因启动子区H3K4me3积聚→基因过度转录→通路异常激活→神经管闭合失败→NTDs。该研究首次将KDM5A确立为叶酸缺乏背景下Wnt/β-catenin通路的关键表观遗传抑制因子，并揭示了PAX2-KDM5A轴在这一过程中的核心调控作用。这不仅深化了我们对叶酸预防NTDs分子机制的理解，将营养因素（叶酸）、转录调控（PAX2）、表观遗传修饰（KDM5A-H3K4me3）和关键信号通路（Wnt/β-catenin）紧密联系起来，构成了一个较为完整的致病机制链条，而且为NTDs的早期诊断、风险预测和潜在的治疗干预提供了新的分子靶点和思路。例如，监测孕妇或胎儿相关组织中KDM5A的表达或H3K4me3的水平或许能成为评估NTDs风险的新指标。同时，该研究也提示，表观遗传调控在营养环境与胚胎发育对话中起着至关重要的作用，这对于理解其他由环境因素导致的先天性畸形也具有重要的启示意义。当然，正如作者所言，研究仍存在一些局限，例如KDM5A完全敲除小鼠的胚胎致死性限制了其在出生缺陷模型中的应用，临床样本量的限制也需要未来更大规模的队列研究来验证。但毋庸置疑，这项发表于《Cell Death & Disease》的工作为我们打开了一扇窥探叶酸神奇作用背后复杂表观遗传世界的新窗口。