超声波处理与碱性处理对姜黄素诱导的酪蛋白-大豆蛋白分离物混合物交联及凝胶化的协同效应

《Ultrasonics Sonochemistry》：Synergistic effects of ultrasonication and alkaline treatment on curcumin-induced cross-linking and gelation of casein-soy protein isolate hybrids

　　可持续食品生产中，超声与碱协同处理诱导姜黄素交联casein和soy protein isolate形成高强度凝胶，揭示了自由基介导与碱驱动的共价交联机制，为酶-free蛋白凝胶制备提供新策略。

　　在当今全球人口不断增长的背景下，食品生产面临着日益严峻的可持续性挑战。动物蛋白因其优异的功能性和感官特性，一直是食品工业中的重要组成部分。然而，其生产过程对环境的影响较大，尤其是在温室气体排放和土地使用方面。相比之下，植物蛋白不仅来源广泛、成本较低，而且在营养和可消化性方面也表现出色，因此，部分替代动物蛋白的策略正在成为研究热点。在这一背景下，研究者们探索了多种方法，以改善植物蛋白的物理化学性质，使其能够更好地应用于食品和非食品领域。其中，利用超声波和碱处理协同作用，诱导姜黄素作为交联剂，形成动物蛋白与植物蛋白的混合凝胶，是一项具有前景的新策略。

本研究旨在探讨是否可以通过超声波产生的自由基，或者结合碱处理，使姜黄素成为连接酪蛋白与大豆分离蛋白的交联剂，从而形成稳定的混合蛋白凝胶。研究通过不同的预处理方式（碱处理、超声波处理，或两者的结合）制备了凝胶，并采用流变学、光谱分析、溶解性测试和显微镜等方法对其特性进行了系统分析。结果显示，只有超声波处理和超声波与碱处理结合的样品能够形成稳定的凝胶，而其中协同处理表现出最强的凝胶网络、最高的交联密度以及最有序的蛋白质结构。这些增强的凝胶特性归因于自由基介导和碱驱动的共价连接的双重作用。本研究为构建混合蛋白凝胶提供了一种新的、无需酶的策略，为开发具有定制质地的植物蛋白食品提供了一种可持续的方案。

蛋白质在食品中扮演着关键角色，不仅是营养来源，还决定了食品的物理化学性质，如质地和口感。它们通过共价和非共价相互作用（如氢键、离子和疏水作用）与其他食品成分相互作用。酪蛋白作为主要的动物蛋白之一，其凝胶性能尤为突出，是牛奶中的主要成分，占其总蛋白含量的约80%。酪蛋白由四种磷酸化蛋白类型组成，包括αS1、αS2、β和κ酪蛋白，这些蛋白类型在结构和功能上具有互补性。酪蛋白基水凝胶表现出良好的机械强度、稳定性、生物相容性和功能特性，如粘附性和可控药物释放能力。然而，关于酪蛋白与植物蛋白之间共价交联的研究仍然有限。

多酚类化合物因其含有酚羟基，能够与蛋白质中的游离氨基或巯基形成共价交联。这一反应通常由多酚氧化酶、自由基或碱性条件所驱动。我们的前期研究表明，通过超声波生成的自由基可以有效地促进多酚与蛋白质之间的共价连接。这种方法相较于传统方法具有反应时间短、无需额外化学试剂或酶的优势。此外，多酚与蛋白质的共价结合显著提升了蛋白质的功能特性，如凝胶性、乳化性、成膜性和冻融稳定性。然而，目前尚不清楚超声波生成的自由基是否能够单独促进多酚作为动物与植物蛋白之间的交联剂，以及其与传统方法（如碱处理）结合是否能够进一步增强交联效果。

基于上述背景，本研究聚焦于姜黄素作为交联剂，在超声波与碱处理协同作用下，诱导酪蛋白与大豆分离蛋白形成混合凝胶的可能性。我们假设超声波与碱处理的协同作用将促进自由基介导和碱驱动的共价连接路径，从而增强交联效率和凝胶性能。为了验证这一假设，我们分别在不同的预处理条件下（碱处理、超声波处理，或两者的结合）制备了复合凝胶，并通过质构分析、流变学、光谱分析、溶解性测试和显微镜等方法对其凝胶行为、物理化学性质、分子间相互作用和结构特征进行了系统评估。研究结果表明，这种新型的、无需酶的策略不仅能够构建混合蛋白凝胶，还可能拓展植物蛋白在可持续食品开发中的应用。

实验材料主要包括来自商业来源的蛋白质和化学试剂。其中，大豆分离蛋白的纯度超过90%，酪蛋白纯度为92%，姜黄素纯度为95%。此外，还使用了DPPH和ABTS等抗氧化剂，以及ANS等荧光探针。所有材料均按照标准操作流程进行配制和处理，以确保实验的准确性和可重复性。

在凝胶制备过程中，酪蛋白和大豆分离蛋白按质量比1:1混合，再与姜黄素按100:1的比例混合，最终配制成10%的水溶液。溶液在室温下用磁力搅拌器以600 rpm的速度搅拌1小时，以实现充分的水合。随后，使用高速均质机以15,000 rpm的速度均质1分钟，以获得均匀的预混合物。为了调节pH值，使用1 M的NaOH将预混合物的pH值调整至9.0，随后在超声波设备中进行超声波处理（20 kHz，400 W，30分钟）。超声波处理在脉冲模式下进行（2秒开启，2秒关闭），并使用冰水浴控制温度在25°C，以防止因高温导致的蛋白质变性。处理完成后，将pH值重新调整至7.0，使用1 M的HCl。根据不同的预处理条件，样品分别标记为CS-AU（超声波-碱处理）、CS-U（超声波处理）、CS-A（碱处理）和CS（对照组，未进行任何处理）。最后，将样品加热至95°C持续30分钟，以诱导凝胶形成。使用数码相机拍摄凝胶的形成状态和视觉特征，以记录其形态变化。

为了评估样品中的游离氨基和巯基含量，采用了o-邻苯二甲醛（OPA）法和改良的DTNB法。OPA法通过溶解OPA于甲醇中，再与钠硼酸缓冲液和十二烷基硫酸钠（SDS）混合，形成工作液。样品在钠硼酸缓冲液中溶解至2 mg/mL浓度，随后与OPA试剂混合并在90°C下加热5分钟以促进反应。使用微孔板读数仪在340 nm波长下测量吸光度，并通过标准曲线计算游离氨基含量。DTNB法则通过将蛋白质样品在Tris-Gly-EDTA缓冲液中进行均质处理，并与Ellman试剂反应，随后在412 nm波长下测量吸光度，计算巯基含量。这两种方法共同揭示了蛋白质在不同处理条件下的结构变化和交联程度。

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了蛋白质亚基的分子量。样品在含有或不含β-巯基乙醇（βME）的加载缓冲液中重新配制，以确定其在非还原和还原条件下的电泳行为。结果显示，在非还原条件下，经过超声波处理或超声波与碱处理的样品中，酪蛋白和大豆分离蛋白的典型亚基（酪蛋白约35 kDa，大豆分离蛋白范围在40-170 kDa）在加热后仍然可见，而在超声波处理组中，这些亚基的条带变得明显变弱，甚至在协同处理组中几乎消失。这表明蛋白质在超声波处理过程中发生了较大的共价交联，形成了不溶性的大分子聚集体。而在还原条件下，亚基的强度显著增加，表明二硫键在凝胶网络的形成中发挥了重要作用。这一发现与之前关于酪蛋白和植物蛋白之间共价交联的研究结果一致，说明姜黄素在促进蛋白质之间的交联方面具有显著作用。

粒子大小分析通过激光衍射粒子大小分析仪进行，以评估样品的物理特性。结果显示，仅经过碱处理或姜黄素处理的样品，其粒子大小主要分布在较小的范围内。而经过超声波处理或超声波与碱处理的样品，其粒子大小明显增加，并且分布主要向大分子部分偏移。这一现象表明蛋白质在超声波作用下发生了聚集，形成更大的结构单元，这与凝胶形成过程中的分子间相互作用密切相关。这一结果与我们之前关于大豆蛋白、油桐籽蛋白和亚麻籽蛋白的研究一致，说明凝胶的形成主要依赖于蛋白质之间的相互作用，而非单一成分的自我聚集。

流变学分析用于评估样品的粘弹行为。采用HR-1型流变仪，使用平行板（直径60 mm，间隙1 mm）进行测试。通过温度扫描测试，观察了样品在加热过程中存储模量（G′）的变化。结果显示，仅经过碱处理或姜黄素处理的样品，其存储模量在加热过程中基本保持不变，而经过超声波处理的样品在约460秒后开始显著上升，表明凝胶网络的形成。对于协同处理组，其存储模量在相同时间点也出现显著上升，但上升幅度明显大于超声波处理组。这表明协同处理不仅增加了蛋白质之间的交联密度，还扩大了反应位点的范围，从而形成了更加紧密和互连的蛋白质-多酚-蛋白质网络。这一双路径模型成功解释了为何协同处理组的凝胶表现出更优异的机械性能。

在频率扫描和蠕变-恢复测试中，进一步验证了协同处理组凝胶的粘弹性特性。存储模量（G′）在不同频率下的表现表明，协同处理组的凝胶形成了更加成熟的、具有良好网络结构的固体。蠕变-恢复测试结果显示，协同处理组的凝胶表现出更低的残余应变，说明其具有更高的弹性和机械强度。通过Burger模型拟合数据，参数E1和E2分别代表瞬时和延迟弹性模量，反映了凝胶的固态行为。而粘度系数（η1）和延迟时间（t2）则分别表示凝胶对流动的阻力和达到最大变形所需的时间。协同处理组的E1、E2和η1值均高于超声波处理组，表明其网络结构更加紧密和稳定。同时，较长的t2值进一步证明了其结构的延展性和稳定性。这些数据表明，协同处理组的凝胶不仅更加坚硬，还能够通过粘性摩擦更有效地耗散能量，从而提升其整体机械性能。

水保持能力和凝胶强度的评估进一步验证了协同处理组的优异性能。结果显示，协同处理组的凝胶表现出更高的水保持能力，这可能是由于其更紧密的网络结构能够有效阻止水分流失。凝胶强度的测试表明，协同处理组的凝胶具有更高的强度，这与存储模量的分析结果一致。这些数据表明，协同处理不仅增强了姜黄素诱导的蛋白质交联，还促进了功能性基团的暴露，使其更积极参与凝胶网络的形成，从而提升了凝胶的整体性能。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析揭示了蛋白质二级结构的变化。结果显示，经过超声波处理或协同处理的样品中，酰胺I带的强度显著增加，表明氢键相互作用的增强。这一现象与之前关于益生菌发酵诱导的大豆蛋白凝胶研究一致，说明氢键在凝胶形成过程中起到了关键作用。此外，协同处理组的样品中，α-螺旋和β-折叠结构的含量最高，表明其蛋白质结构更加有序，这有助于提升凝胶的稳定性。这些结构变化与流变学分析结果相互印证，进一步支持了协同处理组在形成更紧密的蛋白质网络方面的有效性。

表面疏水性的测定通过ANS荧光探针进行，以评估蛋白质表面的疏水性变化。结果显示，经过超声波处理或协同处理的样品表现出显著的疏水性下降，这可能是因为蛋白质在凝胶形成过程中发生了聚集，从而减少了表面疏水性。这一现象与之前关于大豆蛋白和亚麻籽蛋白凝胶的研究一致，表明疏水性降低是蛋白质聚集和凝胶形成的结果。协同处理组的样品表现出最低的表面疏水性，这可能是由于超声波空化和碱处理共同作用，导致蛋白质变性或展开，从而增强了分子间的相互作用。这些结果与流变学数据一致，说明协同处理组的凝胶具有更强的分子间相互作用。

分子间相互作用的分析通过不同提取缓冲液中的蛋白质溶解度进行。结果表明，经过超声波处理或协同处理的样品在所有三种缓冲系统中表现出更低的溶解度，这可能是因为形成了稳定的凝胶网络，限制了蛋白质的溶解。其中，协同处理组的溶解度最低，表明其分子间相互作用最强。这些相互作用包括非共价力和共价键，其中共价键如二硫键和姜黄素交联网络在凝胶结构中起到了关键作用。溶解度分析揭示了不同相互作用在维持凝胶网络中的作用层次，表明非共价相互作用（如氢键和疏水作用）在凝胶的长程连接中占据主导地位，而共价键则为凝胶提供了结构上的强化。

抗氧化活性的评估通过DPPH和ABTS两种方法进行。结果显示，所有样品均表现出自由基清除能力，这主要归因于姜黄素的固有抗氧化特性。其结构中的酚羟基和β-二酮基团能够有效中和自由基。然而，经过超声波处理或协同处理的样品表现出较低的自由基清除能力，这可能是因为姜黄素被包裹在凝胶网络中，减少了其与自由基的接触。另一种可能是姜黄素的酚羟基被用于与蛋白质形成共价键，从而降低了其抗氧化能力。协同处理组的样品中，游离姜黄素含量最低，表明其在凝胶网络中的参与程度最高。这进一步证明了协同处理组的凝胶具有最高的交联效率，其姜黄素主要用于结构构建，而非抗氧化功能。

综上所述，本研究开发了一种无需酶的策略，利用姜黄素作为交联剂，在超声波与碱处理的协同作用下，成功构建了酪蛋白-大豆分离蛋白混合凝胶。协同处理组表现出最强的共价交联，这导致了更高的存储模量、更有序的蛋白质二级结构、更强的分子间相互作用以及更高的水保持能力和凝胶强度。这些结果表明，超声波与碱处理的协同作用不仅增强了交联密度，还扩展了反应位点的范围，从而形成了更加紧密和互连的蛋白质-多酚-蛋白质网络。这一研究为植物蛋白在可持续食品生产中的应用提供了新的思路，并为未来的研究方向奠定了基础，包括工艺放大、感官分析以及拓展至其他蛋白质-多酚系统。