母体分离压力对小鼠扩展杏仁核中CRF能系统的影响及其与急性应激诱发乙醇摄入的关联性

《Alcohol》：The Impact of Maternal Separation Stress on the CRFergic System in the Extended Amygdala and Its Relevance to Acute Stress-Induced Ethanol Consumption in Mice

　　早期生活压力导致啮齿动物酒精消费性别差异及CRF系统改变。C57BL/6J小鼠经产后14天分离后，成年期DID实验显示雌性酒精摄入高于雄性。急性应激测试中雄性MS组更易产生应激反应。分子层面，MS小鼠杏仁核CRF-BP表达升高，下丘脑-边缘系统CRFR1/CRFR2受体分布存在性别特异性改变。

　　研究探讨了母体分离（MS）对酒精消费及在急性应激后CRF系统的影响，特别关注性别差异。实验采用C57BL/6J小鼠作为研究对象，从出生后第1天到第14天实施母体分离程序，对照组则未受到干扰。在出生后第45天，小鼠进入“黑暗饮酒”（DID）实验阶段，持续三周，随后进行固定比率（FR）的酒精自我给药实验。接着，小鼠在渐进比率（PR）强化条件下进行测试。在完成PR实验后，部分小鼠被随机分配接受“大鼠暴露测试”（RET），而另一部分则未接受该测试。最后，所有动物均允许进行一次4小时的酒精暴饮实验。实验结果显示，无论是否经历母体分离，雌性小鼠在DID实验中比雄性小鼠消耗更多的酒精。雄性母体分离小鼠在RET实验中花费更多时间在家中，这一行为与暴饮实验中获得的强化次数及主动鼻 poke（鼻部触碰）行为有关。母体分离但未接受RET的小鼠表现出杏仁核（AMY）中CRF结合蛋白（CRF-BP）的增加和下丘脑室旁核（BNST）中CRFR1受体的减少；而接受RET的小鼠则在AMY中表现出CRFR2受体表达的增加。这些结果表明，母体分离可能通过改变CRF系统影响酒精消费，且这种影响在性别上表现出差异。

母体分离是一种常见的早期生活应激（ELS）模型，被广泛用于研究应激对神经发育和行为反应的长期影响。ELS被认为是成年后酒精使用障碍（AUD）发展的重要环境风险因素。然而，ELS与AUD之间的关系复杂且尚未完全理解。已有研究表明，反复的母体分离应激可能增强成年小鼠的酒精摄入，但性别差异在这一效应中扮演了重要角色。一些研究发现，雌性小鼠在经历母体分离后比雄性小鼠表现出更高的酒精摄入，而另一些研究则指出，雄性小鼠在经历母体分离后可能比对照组摄入更多酒精，而雌性则相反。这种矛盾的结果强调了在研究早期生活应激对AUD的影响时，必须考虑性别差异。

CRF是一种关键的神经肽，其作用主要通过与G蛋白偶联受体（CRFR1和CRFR2）的相互作用来实现，同时CRF-BP也在这一过程中起到调节作用。CRF及其受体在扩展杏仁核（包括BNST、中央杏仁核（CeA）和伏隔核壳部）中的持续激活已被广泛认为与应激诱导的酒精摄入有关。例如，CeA中CRF mRNA表达和CRFR1受体的增加与小鼠在应激条件下的酒精摄入增加相关。同时，BNST中CRFR1受体的抑制可有效减少非应激动物的酒精摄入，与经历社交挫败应激的小鼠相比。尽管CRFR2和CRF-BP在应激与酒精摄入之间的具体作用仍不明确，但一些研究指出，将CRFR2拮抗剂注入BNST会增加应激和非应激小鼠的酒精摄入。此外，CRF-BP基因的多态性在同时患有AUD和焦虑障碍的个体中更为常见。

母体分离已被证明可以增加CeA和BNST中CRF和CRFR1的表达，无论性别如何。在雄性小鼠中，经历其他应激后，MS小鼠表现出CRFR2表达的增加。然而，其他研究却显示出不同的结果，表明在CeA中，MS与对照组之间可能存在CRF mRNA、CRF免疫反应细胞、CRFR1和CRFR2表达的减少或无明显差异。尽管有大量证据表明MS会在扩展杏仁核中引发持久的CRF系统变化，但这些变化是否影响应激诱导的酒精摄入在生命早期和后期阶段，以及是否具有性别差异，仍不明确。

本研究旨在探讨母体分离应激对酒精摄入、对异质应激的反应以及扩展杏仁核中CRF系统分子变化的长期影响。我们假设早期生活应激会（1）影响成年动物的酒精摄入，（2）改变对异质应激的反应，（3）这些影响会在性别上表现出差异。此外，我们还假设这些影响会以性别依赖的方式改变CRF系统。为了验证这些假设，我们采用了多种实验方法，包括DID、FR、PR、RET和暴饮实验，以全面评估母体分离对小鼠行为和神经机制的影响。

在伦理方面，本研究遵循巴西法律关于动物实验的相关规定，并获得了巴西联邦大学圣保罗分校（UNIFESP）伦理委员会的批准，批准号为5360240918。所有实验均在符合伦理标准的条件下进行，确保动物的福利和实验的科学性。实验动物的使用和处理均遵循相关的动物保护法规，实验过程受到严格监控，以减少动物的痛苦和不适。

在实验设计方面，我们选择了20-30克、12周龄的C57BL/6J小鼠，分为10只雄性和10只雌性，共计20只小鼠。实验分为多个阶段，包括母体分离、DID、FR、PR、RET和暴饮实验。在DID实验中，我们记录了小鼠每周五天的酒精摄入数据，并以估计边缘均值及其对应的95%置信区间进行表达。广义线性混合模型（GLMM）分析未显示性别或应激的主要效应，以及性别与应激、应激与时间或性别、应激和时间的三重交互效应。然而，GLMM分析表明存在性别与时间的交互效应，即雌性小鼠在第2周和第3周的酒精摄入量高于雄性小鼠（W2: β=...）。这一结果支持了我们关于母体分离对酒精摄入存在性别差异的假设。

在行为测试方面，我们使用了RET来评估小鼠在经历异质应激后的反应。实验结果显示，雄性母体分离小鼠在RET中表现出更多的停留时间，这与暴饮实验中的强化次数和主动鼻 poke行为有关。此外，我们还观察到母体分离但未接受RET的小鼠在AMY中表现出CRF-BP的增加，而在BNST中表现出CRFR1的减少。相反，接受RET的小鼠在AMY中表现出CRFR2的增加。这些结果表明，母体分离可能通过改变CRF系统影响酒精摄入，并且这种影响在性别上表现出差异。

在讨论部分，我们分析了实验结果，并探讨了母体分离对酒精消费和行为反应的影响。研究发现，母体分离确实引发了对酒精消费和异质应激反应的持久影响，且这些影响在性别上表现出差异。然而，关于CRF系统是否受到这些事件的影响，研究结果并不完全支持我们的假设。我们观察到，尽管母体分离影响了CRF系统，但这种影响并非性别依赖的。这可能意味着CRF系统的变化在性别之间并不一致，或者其作用机制在不同性别中有所不同。

综上所述，本研究揭示了母体分离对小鼠酒精消费和行为反应的长期影响，特别是对异质应激的反应。实验结果表明，这种影响在性别上存在差异，但CRF系统的变化则可能不具性别差异。这些发现为理解早期生活应激与酒精使用障碍之间的关系提供了新的视角，并为未来的研究提供了方向。进一步的研究可以探讨CRF系统在不同性别中的具体作用机制，以及其在应激诱导的酒精摄入中的潜在角色。此外，研究还可以考虑其他类型的应激模型，以更全面地评估母体分离对行为和神经机制的影响。

在数据可用性方面，本研究的原始数据将在请求时由通讯作者提供。这确保了研究结果的透明度和可验证性，同时也为后续研究提供了参考。此外，本研究的撰写过程中使用了生成式人工智能工具（如ChatGPT）来提高文章的可读性和语言表达，但作者们在使用该工具后对内容进行了审阅和编辑，确保了文章内容的准确性和科学性。

本研究还声明了不存在可能构成利益冲突的商业或财务关系。这表明研究结果的客观性和独立性，确保了实验数据的可信度。此外，研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）和巴西高等教育协调委员会（CAPES）的支持。具体而言，Natalia Bertagna获得了CAPES研究奖学金和FAPESP的资助编号2020/04389-3，Fabio Cardoso Cruz获得了FAPESP的资助编号2018/15505-5。这些资助确保了研究的顺利进行，并为实验提供了必要的资源和支持。

总之，本研究通过系统实验方法探讨了母体分离对小鼠酒精消费和行为反应的长期影响，特别是对异质应激的反应。研究结果表明，这种影响在性别上存在差异，但CRF系统的变化可能不具性别差异。这些发现为理解早期生活应激与酒精使用障碍之间的关系提供了新的视角，并为未来的研究提供了方向。进一步的研究可以探讨CRF系统在不同性别中的具体作用机制，以及其在应激诱导的酒精摄入中的潜在角色。此外，研究还可以考虑其他类型的应激模型，以更全面地评估母体分离对行为和神经机制的影响。