《Evolving Earth》：Timeless prevents senescence-associated phenotypes and enhances DNA repair to promote esophageal cancer cell growth
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食管鳞状细胞癌（ESCC）中Timeless的上调促进肿瘤进展，其缺失引发DNA损伤反应增强，抑制Fanconi贫血（FA）通路和同源重组修复，导致细胞衰老、集落形成及三维器官生成能力下降，提示Timeless是ESCC治疗潜在靶点。
野口千明|卡莉丝·I·霍恩|泰勒·布鲁斯特|艾丽莎·达菲|吉尔·P·沙阿|安珀·特里亚乌|奥利维亚·埃尔·纳加尔|苏米娅·瓦维拉拉|希瓦尼·谢特|野口英志
美国宾夕法尼亚州费城德雷塞尔大学医学院生物化学与分子生物学系
摘要
食管鳞状细胞癌（ESCC）是最致命的鳞状细胞癌类型之一，约占所有食管癌病例的90%。我们之前的研究表明，范可尼贫血DNA修复（FA）通路可以减轻复制压力，从而维持食管癌细胞的自我更新能力，这突显了减少复制压力在食管癌增殖中的关键作用。在这项研究中，为了进一步探讨复制压力在食管癌生长中的作用，我们研究了Timeless的功能，Timeless是复制叉保护复合体的一个关键亚基，对防止复制压力至关重要。我们的研究发现，Timeless在食管癌细胞中上调，其缺失会增加细胞对DNA损伤因子的敏感性，导致食管角质形成细胞发生衰老。Timeless的缺失还会增强DNA损伤反应，同时降低与FA通路和同源重组相关的DNA修复蛋白的表达。此外，Timeless的缺失会损害细胞在软琼脂中的克隆形成能力，并降低形成3D类器官所需的自我更新能力。这些结果表明，Timeless在促进DNA修复和食管癌进展中起着关键作用，可能成为开发有效治疗策略的潜在靶点。
引言
食管癌是全球第六大癌症相关死亡原因[1]。它主要分为两种类型：食管腺癌和食管鳞状细胞癌（ESCC）。其中ESCC更为致命，占食管癌病例的90%[1]、[2]。由于大多数食管癌患者诊断时已处于晚期，且现有标准治疗方法效果不佳，ESCC的预后较差，五年生存率低于20%[1]、[2]。因此，迫切需要开发新的治疗手段来应对ESCC。
饮酒过量的人群中ESCC的发病率较高[2]。酒精会导致乙醛在体内积累，而乙醛是乙醇的主要代谢产物，也是一种主要的人类致癌物[3]。因此，乙醛解毒能力缺陷（ALDH2缺乏）的人患ESCC的风险更高[4]。乙醛可引起DNA损伤，包括链间交联（ICLs）[3]，这些损伤会干扰复制机制，导致复制压力和DNA损伤[5]。我们之前的研究表明，范可尼贫血DNA修复（FA）通路可以减轻食管角质形成细胞因乙醛暴露而产生的复制压力。我们发现FA通路的关键成分FANCD2对ESCC细胞的自我更新能力至关重要，这表明复制压力管理在支持肿瘤生长中起着作用[6]。最近的一项使用单细胞RNA测序方法的研究表明，预后较差的ESCC患者中与复制压力反应相关的基因表达升高，这表明复制压力相关基因可作为预后生物标志物和潜在的治疗靶点[7]。
多种环境因素、治疗药物和代谢产物都可能导致DNA损伤和复制压力，从而引发基因组不稳定，这是癌症的特征。作为对复制压力的响应，细胞会激活ATR-Chk1依赖的细胞周期检查点，以暂停细胞周期并促进DNA修复[8]。这一过程由Timeless-Tipin复制叉保护复合体（FPC）介导，FPC是复制体的一个重要组成部分。Timeless是FPC的主要亚基，负责维持基因组的完整性。Timeless在DNA损伤时稳定复制叉，介导DNA损伤检查点信号，以暂停细胞周期，并在DNA复制过程中促进DNA修复[9]。
除了在防止复制压力中的核心作用外，多项研究表明Timeless还参与肿瘤进展。它在多种癌症中过表达，并与患者较差的生存率相关[10]、[11]。Timeless似乎通过维持癌干细胞、促进乳腺癌发展[12]以及赋予对顺铂（一种诱导ICL的物质）的耐药性来促进肿瘤进展，同时伴随EMT和Wnt/β-连环蛋白通路的激活[13]、[14]。尽管这些研究显示了Timeless与促肿瘤通路之间的关联，但它们并未阐明Timeless介导肿瘤进展的机制。此外，Timeless如何将基因组维持通路与其促肿瘤效应联系起来仍不清楚。
在这项研究中，我们发现Timeless在食管癌细胞中上调，其缺失会触发DNA损伤反应，导致细胞衰老。我们还发现Timeless通过范可尼贫血通路增强DNA修复能力，从而支持ESCC细胞的生长，这表明它可能成为降低食管肿瘤增殖能力的潜在治疗靶点。我们的发现为设计未来旨在开发有效预防和治疗食管癌的动物研究奠定了基础。
部分摘录
食管癌细胞中Timeless及其相关因子表达升高
Timeless在多种癌症中过表达，并与较差的预后相关。一致地，Timeless的缺失可减缓包括乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和肝癌在内的多种癌症的进展[12]、[15]、[16]、[17]。然而，Timeless在食管鳞状细胞癌（ESCC）发展中的作用尚不清楚。我们分析了Oncomine数据库中的全基因组数据，发现Timeless在ESCC患者中上调（图1A）。
然后我们
讨论
研究表明，Timeless的缺失可降低乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和肝癌的增殖能力[12]、[15]、[16]、[17]。虽然这些研究表明Timeless对癌症增殖的影响，但其支持肿瘤生长的具体机制尚不清楚，也不清楚Timeless如何影响食管癌的发生。有趣的是，Timeless的表达与c-Myc和Wnt信号通路的升高有关，这两种通路都起着关键作用
细胞培养及相关程序
如前所述，永生化的人类角质形成细胞（EPC1-hTERT和EPC2-hTERT）在不含血清的角质形成细胞培养基中培养，该培养基添加了50 μg/ml的牛垂体提取物、1 ng/ml的重组人表皮生长因子、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素。TE11细胞则在添加了10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养。对于药物治疗，细胞与10 mM的VE-822（Selleck Chemicals, S7102）和1 μM的CRediT作者贡献声明
苏米娅·瓦维拉拉：方法学、正式分析。希瓦尼·谢特：资源、方法学。野口英志：写作——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。吉尔·P·沙阿：正式分析、研究。安珀·特里亚乌：方法学、研究、正式分析。奥利维亚·埃尔·纳加尔：研究、正式分析。
数据和资源可用性
支持本研究的所有数据可向通讯作者索取。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来纠正语法错误并改进语言。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。利益冲突声明
作者声明与本文描述的研究无关任何利益冲突。
所附的手稿完全原创，未曾在其他地方发表，也未被考虑发表。所有作者均符合期刊的作者资格要求，并已批准提交。
致谢
我们感谢Noguchi实验室的成员Karen Berkowitz博士和Christian Sell博士的支持、评论和鼓励。本研究得到了W. W. Smith慈善信托基金（编号#2007和#C2106给EN）以及德雷塞尔大学医学院的支持。
