IgG抗体亲和力检测与胎盘实时PCR技术在活性母体弓形虫病诊断中的应用：其与妊娠结局的关系

《Experimental and Molecular Pathology》：IgG avidity and placenta real-time PCR in detection of active maternal toxoplasmosis: relation to pregnancy outcomes

　　视网膜厚度与GFAP表达急性眼压升高的动态变化研究。通过激光光凝诱导大鼠右眼急性眼压升高，结合SD-OCT和免疫荧光技术，发现视网膜全层厚度在术后1周显著增加（23.4±6.4μm vs 20.1±3.7μm），持续9周，且神经纤维层厚度增加比例最高（22.2±12.5%），伴随GFAP在Müller细胞终足显著上调（p<0.001）。该研究挑战了传统青光眼早期视网膜神经纤维层变薄的观点，揭示了急性IOP升高可能通过激活Müller细胞引发视网膜结构代偿性增厚。

　　本研究聚焦于急性眼内压（IOP）升高对大鼠视网膜厚度的影响。研究人员通过激光光凝术诱导大鼠右眼的IOP升高，同时将左眼作为未处理对照组。利用自建的光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）系统，对大鼠视网膜进行了实时成像，以评估视网膜各层的厚度变化。此外，还通过免疫荧光染色技术检测了胶质细胞的反应情况，特别是通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达来评估胶质细胞的活动状态。研究结果显示，激光处理后，大鼠的IOP在第一天显著上升，达到31.4±6.4 mmHg，但在第二天大多数动物的IOP已恢复至正常水平（10.1±2.0 mmHg）。研究团队对视网膜厚度进行了为期四周的跟踪观察，其中五只大鼠还进行了长达九周的跟踪。

### 研究背景

眼内压升高是导致青光眼的主要风险因素之一，而青光眼是全球范围内导致视力丧失的主要原因之一。青光眼的特点是视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突在视网膜神经纤维层（RNFL）和视神经中的逐渐退化。尽管数百年前人们就已经认识到高眼内压与青光眼之间的关系，但其引发青光眼的具体机制仍未完全明确。目前认为，高眼内压可能通过机械应力和血管损伤等途径影响视网膜结构。通常，RNFL变薄是青光眼损伤的一个标志性变化，而通过光学相干断层扫描（OCT）技术可以检测到这种变化。OCT已被广泛用于监测青光眼的进展和状态变化。

动物模型在理解青光眼的病理生理学方面发挥了重要作用。在大鼠中，可以通过向前房注入阻塞物质、激光光凝术或阻断睫状血管等方法来诱导眼内压升高。已有研究表明，持续的眼内压升高会导致RGC的损失和RNFL的变薄。然而，本研究中探讨的是急性眼内压升高对视网膜厚度的影响，与传统的持续性眼内压升高模型不同。

### 研究方法

本研究遵循了动物伦理标准，所有实验均按照美国眼科学与视觉研究协会（ARVO）的动物使用声明进行，并符合迈阿密大学动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针。实验中使用了2-3个月龄的雌性Wistar大鼠。在激光光凝术前，大鼠被麻醉，采用皮下注射含氯胺酮和右旋咪唑的混合液，并在角膜上使用1%的丙二醇滴眼液进行局部麻醉。激光光凝术使用的是NIDEK GYC-1000型二极管激光器，其参数包括波长532 nm、功率700 mW、光斑尺寸200 μm、每个光斑持续0.5秒。激光束被聚焦于房水排出通道（trabecular meshwork），并在右眼均匀分布40个激光点。左眼未接受任何处理，作为对照组。在麻醉后立即使用反弹式眼压计（TonoLab）测量眼内压，之后每天在上午10点左右测量左右眼的眼内压，持续四周。

为了获取视网膜的实时图像，研究人员使用了一台自建的双波段SD-OCT系统，能够同时获取近红外（NIR，中心波长830 nm）和可见光（VIS，中心波长480 nm）图像，其成像速度可达到每秒70000条A线。在本研究中，主要使用NIR-OCT来监测视网膜各层的厚度变化，其空气中的分辨率约为6 μm。使用了栅格扫描和圆形扫描两种模式，均以视神经盘为中心。栅格扫描由512（水平）×128（垂直）的深度扫描组成，覆盖视网膜上3 mm×3 mm的区域。圆形扫描由32个同心圆组成，直径从1 mm均匀分布到2.5 mm，每个圆包含2048条深度扫描。每张三维体积扫描所需时间少于1秒。

研究人员测量了视网膜的两个区域的厚度：一个是包含RNFL、神经节细胞（GCs）和内丛状层（IPL）的从内界膜（ILM）到内核层（INL）内缘；另一个是包含所有视网膜层的从ILM到视网膜色素上皮（RPE）。视网膜层的边界由两名不了解实验条件的操作员手动绘制。视网膜厚度的平均值是通过计算每个扫描点的厚度值得到的。厚度值首先以像素为单位计算，然后通过校准系数1.29 μm/像素转换为微米单位，该系数考虑了视网膜的折射率（约1.4）的影响。

为了进一步分析视网膜的形态学变化，研究人员在激光处理后四周，对视网膜进行了组织学和免疫组织化学分析。大鼠被使用二氧化碳过量麻醉后，通过混合醛类进行血管灌注。随后，眼球被嵌入Epon/Araldite混合物中，切成1 μm厚的半薄塑料切片，用于显示视网膜的垂直断面。视网膜切片使用苏木精染色，并通过光学显微镜进行观察。

在GFAP免疫染色方面，研究人员使用了4%的多聚甲醛进行血管灌注，随后使用20%的蔗糖进行冷冻保护，并嵌入Tissue-Tek OCT化合物中。切片（10 μm）在?20°C下使用冷冻切片机切割，并在Super Frost Plus玻璃载片上进行固定。切片在4°C下孵育过夜，使用MA5-12023抗GFAP抗体进行免疫染色。GFAP的免疫反应通过Cy2偶联的二抗进行可视化，持续1小时。细胞核则使用DAPI进行染色。荧光信号通过共聚焦显微镜（LSM700；Carl Zeiss）进行分析。

为了量化RGCs的数量，研究人员在激光处理后10天，对眼球进行收集，并使用GTX118619抗RBPMS抗体进行免疫染色。RBPMS的免疫反应通过Cy2偶联的二抗进行可视化。之后，将视网膜切成四个象限（上、下、鼻、颞），在载片上进行固定，并使用共聚焦显微镜进行观察。每个象限在距离视神经头0.5 mm、1 mm和1.5 mm处各选取五个视野进行计数。细胞计数由CellProfiler（V4.2.8）辅助完成。每个视网膜的20张图像（四个象限各五个视野）的RGC数量平均后，计算RGC密度。

在另一项平行实验中，研究人员对视网膜神经纤维层（RNFL）的细胞骨架进行了分析。使用共聚焦显微镜对F-actin进行染色，观察其在RNFL中的分布情况。激光处理后，大鼠的眼内压在三天内保持升高状态。实验过程中，眼球在4%的多聚甲醛中进行血管灌注后，被切出5 mm直径的视神经杯。随后，组织在磷酸缓冲盐水中进行渗透处理，使用0.8%的TritonX-100处理1小时，并在室温下孵育5%的牛血清白蛋白和0.8%的TritonX-100作为阻断剂。组织在PBS中彻底洗涤后，使用Alexa Fluor?488偶联的Phalloidin（1:40）进行F-actin的标记，持续1小时。标记后，视网膜被彻底洗涤，固定在载片上，并在4°C下保存至成像。视网膜的共聚焦图像使用Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜进行获取。使用40倍和63倍的油浸物镜，成像区域为387.5 μm×387.5 μm，采样密度为0.76 μm/像素。

在统计分析方面，数据以均值±标准差（SD）的形式呈现。使用R 4.5.0版本进行配对t检验，比较处理组和对照组在不同周数下的全视网膜厚度和内视网膜厚度。p值小于0.05被认为是统计学显著。

### 研究结果

激光光凝术成功诱导了大鼠的眼内压升高。在处理后的第一天，处理组的眼内压显著升高，达到31.4±6.4 mmHg，而在第二天，大多数大鼠的眼内压已恢复至正常水平（10.1±2.0 mmHg）。处理组在四周内的眼内压没有明显的波动。

在四周的跟踪观察中，研究人员对14只大鼠进行了视网膜成像，其中5只进行了九周的跟踪。在激光处理后的第一天，许多大鼠的角膜出现轻微的不透明，但通常在两天至三天内恢复，从而允许获取高质量的OCT图像。OCT图像显示，处理组的视网膜厚度显著高于基线和对照组。在处理后的第一周，处理组的视网膜厚度显著增加，达到峰值后在第四周仍保持显著增厚。从补偿后的结果来看，处理组的视网膜厚度和内视网膜厚度均表现出相似的趋势，即在处理后的第二周达到峰值，之后逐渐下降，但直到第九周仍保持增厚。

通过组织学分析，研究人员发现处理组的视网膜明显增厚，特别是在内视网膜区域，尤其是RNFL。处理组的视网膜厚度变化与OCT图像结果一致，表明视网膜增厚可能与急性眼内压升高有关。此外，GFAP免疫染色结果显示，处理组的GFAP表达显著增加，主要集中在视网膜内层的Müller细胞端足，与RNFL的增厚一致。这些结果表明，GFAP的上调可能与视网膜结构变化有关。

在RGC数量的量化分析中，研究人员发现处理组的RGC密度在处理后的第十天与对照组没有显著差异，表明急性眼内压升高可能并未导致RGC的明显损失。在另一项平行实验中，研究人员观察到处理组的RNFL中F-actin的分布发生了改变，显示了视网膜神经纤维束的结构变化。同时，处理组的视网膜厚度显著增加，表明视网膜层的增厚可能与细胞骨架的改变有关。

### 讨论

本研究发现，急性眼内压升高会导致大鼠视网膜厚度的显著增加，这一结果与传统的持续性眼内压升高模型中的RNFL变薄现象不同。通过OCT的实时监测，研究人员发现视网膜增厚在处理后的第一周显著，第二周达到峰值，并在第九周仍保持增厚。这种增厚主要发生在视网膜的内层，尤其是RNFL。这些结果通过组织学分析得到了验证，表明视网膜增厚可能是一个早期反应。

考虑到视网膜厚度的增加涉及所有视网膜层，而Müller细胞是唯一能够延伸至视网膜所有层的细胞类型，研究人员推测Müller细胞可能是导致视网膜增厚的主要细胞类型。GFAP的上调主要集中在Müller细胞端足，这与RNFL的增厚一致，支持了这一假设。Müller细胞作为视网膜的主要胶质细胞，提供结构和功能支持，并表达机械感受器TRPV4，被认为是视网膜的主要机械传感器。因此，Müller细胞可能在眼内压升高时被激活，通过延长细胞体或重塑细胞外基质来增强视网膜的结构。

尽管GFAP的上调可能与RNFL的增厚有关，但研究人员也指出，星形胶质细胞可能在RNFL增厚中发挥作用。由于星形胶质细胞主要局限于RNFL，因此它们可能不直接参与视网膜整体的增厚，除非是在RNFL区域内。由于GFAP可以标记反应性Müller细胞和星形胶质细胞，而星形胶质细胞在高眼内压下可能表现出反应性，因此它们在RNFL增厚中的作用也不能排除。

在其他研究中，也报道了急性眼内压升高导致的RNFL增厚现象，如在50 mmHg眼内压持续8小时的模型中，RNFL厚度增加了15-19%，且这种增厚效应持续了3周。此外，在视神经挤压模型中，3-12天内可能会出现RNFL的暂时性增厚，作为早期的炎症反应。本研究中的模型为急性（1-2天）眼内压升高，这可能更贴近临床中的急性眼内压升高情况，如原发性闭角型青光眼（PACG）或继发性闭角型青光眼（SACG）。与慢性青光眼模型不同，本研究强调了急性眼内压升高导致的视网膜增厚这一早期反应。

GFAP的上调可能与文献中报道的视网膜神经纤维束的光学反射有关。为了进一步验证这一假设，未来的研究可以采用GFAP和F-actin的共染色实验，以直接检测GFAP对视网膜神经纤维束反射的贡献。

研究还发现，尽管处理组的视网膜厚度和结构发生了变化，但在处理后的第十天，RGC的密度与对照组没有显著差异。这可能表明，视网膜增厚和细胞骨架的破坏发生在RGC损失之前，或者这种增厚可能是一种视网膜的保护性反应。未来的研究可以进一步探讨这种增厚是否是可逆的神经保护状态，还是不可逆的退化过程的早期迹象。

本研究仅在雌性大鼠中进行，因此其结果可能不适用于雄性大鼠。未来的研究需要包括雄性大鼠，以确保结果的普遍性。

### 结论

本研究发现，急性眼内压升高会导致大鼠视网膜各层的显著增厚，而激活的胶质细胞可能在这一过程中起关键作用。这一发现强调了在急性眼内压升高早期阶段，视网膜增厚的重要性。进一步研究视网膜增厚的机制，可能有助于加深对青光眼的理解，并为新的治疗方法提供依据。