暴露于华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）细胞外囊泡的库普弗细胞（Kupffer cells）的转录组分析：揭示CSF3在肝纤维化中的作用

《Food and Waterborne Parasitology》：Transcriptomic profiling of Kupffer cells exposed to Clonorchis sinensis extracellular vesicles: Unraveling the role of CSF3 in hepatic fibrosis

　　肝纤维化相关基因差异表达及CSF3调控机制研究。

　　### 研究背景与意义

肝吸虫病是由肝吸虫（*Clonorchis sinensis*）引起的一种重要的公共卫生问题，主要流行于中国及东亚地区。该病不仅对宿主的肝脏造成显著的病理损害，还可能诱发慢性炎症、肝纤维化甚至胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）等严重后果。尽管目前已有多种治疗方法，如使用吡喹酮（praziquantel）进行治疗，但其副作用和耐药性问题仍然存在，限制了其长期使用和治疗效果。因此，深入研究肝吸虫感染的病理机制，尤其是其对肝纤维化的贡献，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

肝巨噬细胞（Kupffer cells, KCs）是肝脏中主要的免疫细胞，具有重要的免疫调节功能。在感染过程中，KCs能够通过释放细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β），激活肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs），进而促进细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的合成，抑制胶原酶的产生，降低胶原的降解，最终导致肝纤维化。此外，肝吸虫感染还会引发一系列免疫反应，包括炎症因子的释放和细胞因子信号通路的激活，这些反应可能与肝纤维化的发生和发展密切相关。

为了更好地理解肝吸虫感染对肝纤维化的影响，研究人员对肝吸虫的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）进行了分离与鉴定，并研究了其在KCs中的摄取情况。EVs是细胞分泌的一种膜结构，包括外泌体（exosomes）和微囊泡（microvesicles），它们在细胞间通讯中发挥着重要作用，能够携带蛋白质、脂质和遗传物质，从而影响宿主的免疫反应和病理过程。已有研究表明，其他寄生虫如肝片形吸虫（*Schistosoma japonicum*）和多头带绦虫（*Echinococcus multilocularis*）释放的EVs在宿主肝损伤和纤维化过程中起着关键作用。然而，肝吸虫EVs（CsEVs）在KCs中的具体作用及其对肝纤维化的潜在影响，仍缺乏系统的分析。

### 研究方法与技术手段

为了全面了解CsEVs对KCs的影响，研究人员采用了多种实验手段，包括细胞培养、EVs的分离与鉴定、RNA测序（RNA-seq）以及生物信息学分析。首先，CsEVs通过差速离心法从感染的兔体内提取，并使用透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）和纳米粒子追踪分析仪（nanoparticle tracking analysis, NTA）对EVs的形态和大小进行了表征。结果显示，CsEVs具有典型的“碗状”结构，直径约为100纳米，且其浓度为2.2×1012颗粒/毫升。

随后，研究人员通过流式细胞术（flow cytometry）对KCs进行了鉴定，检测了其标志物F4/80和CD11b的表达。实验结果表明，KCs的纯度较高，且F4/80阳性细胞的比例可达90%。此外，通过免疫荧光分析，研究人员确认了CsEVs能够被KCs有效摄取，并且其在体外和体内均能影响KCs的基因表达。

在基因表达分析方面，研究人员使用RNA-seq技术对KCs在CsEVs刺激后的基因表达变化进行了全面研究。实验结果显示，共有694个基因的表达水平发生了显著变化，其中包括上调的*colony-stimulating factor 3*（*CSF3*）、*interleukin 1 beta*（*IL1b*）等基因。通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析，这些基因主要参与了炎症反应、细胞因子信号传导以及NF-κB信号通路等生物学过程。这表明，CsEVs可能通过激活这些通路，导致KCs的异常反应，从而促进肝纤维化的发生。

此外，研究人员还通过定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对部分差异表达基因进行了验证。结果显示，*CSF3*和*IL1b*等基因在感染肝吸虫的KCs中表达显著上调，与RNA-seq的结果高度一致。进一步的免疫组化（immunohistochemistry, IHC）分析也显示，*CSF3*的表达水平在感染组中显著高于对照组，且其表达水平与α-SMA的表达呈正相关，α-SMA是HSCs的一个重要标志物，其水平的升高通常与肝纤维化的进展密切相关。

为了探讨*CSF3*与肝纤维化之间的关系，研究人员还建立了一个KCs与HSCs共培养的实验模型。在该模型中，当KCs被CsEVs刺激后，*CSF3*的表达水平显著升高，并且通过抑制*CSF3*的表达，可以明显降低HSCs中α-SMA的表达。这一结果表明，*CSF3*可能在肝吸虫感染导致的肝纤维化过程中发挥关键作用。

### 研究结果与发现

本研究首次揭示了CsEVs对KCs的基因表达影响，并发现*CSF3*是其中最显著上调的基因。*CSF3*的表达水平与肝纤维化密切相关，其上调可能通过激活IL-17和JAK/STAT等信号通路，促进炎症反应和纤维化进程。此外，研究还发现，CsEVs能够通过KCs释放的细胞因子和趋化因子，影响肝脏微环境，从而加剧肝损伤。

在病理分析方面，研究人员对感染肝吸虫的小鼠肝脏进行了组织学分析，包括H&E染色、Masson染色和Picro Sirius Red（PSR）染色。结果显示，随着感染时间的延长，肝脏的病变程度逐渐加重，包括肝组织的肿胀、颜色变化以及胶原沉积的增加。这些变化与*CSF3*和α-SMA的表达水平上升相吻合，进一步支持了*CSF3*在肝纤维化中的作用。

值得注意的是，虽然*CSF3*在感染后表达显著升高，但在感染的第五周，α-SMA的表达水平出现了下降。这一现象可能与肝脏的修复过程有关，因为在肝损伤的修复阶段，激活的HSCs可能会发生凋亡，从而减少其数量和α-SMA的表达。然而，这种修复过程并未完全阻止肝纤维化的进展，表明*CSF3*在肝吸虫感染导致的肝纤维化中可能具有持续的促进作用。

此外，研究还发现，*CSF3*的表达水平与肝纤维化密切相关，且其在多种疾病模型中均表现出类似的上调趋势。例如，在酒精诱导的肝损伤模型中，*CSF3*的表达水平显著升高，且与炎症体的形成和神经炎症的激活相关。这些发现表明，*CSF3*可能在多种肝病的病理过程中发挥重要作用，包括肝吸虫感染、酒精性肝病以及肝癌等。

### 研究意义与展望

本研究首次系统地分析了CsEVs对KCs的基因表达影响，并揭示了*CSF3*在肝吸虫感染导致的肝纤维化中的潜在作用。这些发现不仅为肝吸虫病的病理机制提供了新的科学依据，还可能为肝纤维化的治疗提供新的靶点。由于目前针对肝吸虫感染的肝纤维化治疗手段有限，因此，明确*CSF3*的作用机制对于开发新的治疗策略具有重要意义。

此外，本研究还强调了EVs在寄生虫感染中的重要性。EVs不仅是细胞间通讯的重要媒介，还可能通过携带特定的分子信号，影响宿主的免疫反应和病理过程。例如，肝片形吸虫释放的EVs可能通过激活NF-κB信号通路，促进炎症反应和肝损伤；而多头带绦虫释放的EVs则可能通过抑制NF-κB信号通路，减少肝损伤的发生。因此，EVs在寄生虫感染中的作用可能因不同的寄生虫种类而异，这也提示了在研究寄生虫感染时，需要考虑不同寄生虫释放的EVs对宿主细胞的不同影响。

综上所述，本研究不仅揭示了CsEVs在肝吸虫感染中的作用机制，还为肝纤维化的治疗提供了新的思路。未来的研究可以进一步探讨*CSF3*的具体作用机制，以及其在其他寄生虫感染中的表达情况，从而为相关疾病的治疗提供更全面的理论支持和实践指导。