通过非靶向代谢组学研究工业生产宽豆酱过程中非挥发性代谢物的变化趋势

《Food Research International》：Changing trends of non-volatile metabolites during industrial broad bean paste production via untargeted metabolomics

　　本研究采用未标记代谢组学方法分析工业豆浆酱（BBP）发酵过程中非挥发性代谢物的组成与动态变化，鉴定了1992种代谢物，并揭示氨基酸代谢（27.94%）和次生代谢物生物合成（14.29%）为主要代谢途径。通过OPLS-DA和随机森林分析预测了75种具有潜在生理功能的代谢物及其动态趋势，为工业化生产优化提供理论依据。

　　

牛成拓|陈书赫|左文军|刘春峰|李琦

中国江南大学生物技术学院工业生物技术重点实验室，教育部，无锡214122

摘要

豆瓣酱（BBP）是一种流行的发酵调味品。以往的研究主要集中在BBP的微生物群落和风味分析上，然而关于工业发酵过程中非挥发性代谢变化的信息仍然不明确。因此，本研究采用非靶向代谢组学方法详细分析了工业生产过程中BBP中非挥发性代谢物的组成及其变化趋势。共鉴定出1992种非挥发性代谢物。通过KEGG数据库的整合分析表明，氨基酸代谢（27.94%）和次级代谢物生物合成（14.29%）是主要的代谢途径。在发酵初期到中期，碳水化合物代谢和氨基酸代谢显著增强，而次级代谢物合成代谢在发酵中后期占主导地位。利用OPLS-DA和随机森林分析预测了差异代谢物。最终，共预测出75种具有潜在生理功能的代谢物，并提供了它们的变化趋势。这些结果有助于我们更深入地了解工业发酵过程中BBP中代谢物的组成及其变化规律。

引言

食品发酵是一种利用微生物的代谢活动来提高原材料利用率、改善感官特性并延长食品保质期的有益过程（Tamang等人，2020年）。这一技术深深植根于人类文化的历史中，至今仍受到数百万消费者的喜爱（Ray等人，2024年）。作为传统发酵食品的典型代表，豆瓣酱（BBP）是通过开放式系统中的“白天晒制、夜间露水浸泡”工艺，利用黄豆（Vicia faba L.）和小麦粉经过微生物发酵制成的（Lu等人，2021年；Zhao等人，2024年）。由于其易消化性、独特的酱香和丰富的营养成分，BBP常用于日常烹饪或作为调味品（Jia等人，2020年）。目前BBP产业的年产量已超过100万吨，年产值超过100亿元人民币（Xu等人，2022年）。BBP的生产过程通常包括两个步骤：制曲和醪液发酵。在制曲过程中，Aspergillus oryzae在黄豆和小麦粉的混合物上生长，产生多种酶，将原料中的大分子（主要是蛋白质和淀粉）降解为低分子量物质（如氨基酸和葡萄糖）（Zhu & Tramper，2013年）。随后，成熟的koji与高盐度盐水混合以启动发酵。在此过程中，微生物群落将氨基酸和寡糖转化为多种挥发性或非挥发性化合物，最终形成BBP的风味（Yu等人，2022年）。

BBP的发酵过程非常复杂，其背后的机制尚未完全阐明。当前的研究主要集中在发酵过程中微生物群落的结构和功能研究（Lin等人，2021年；Liu等人，2020年；Zhao等人，2023a年），以及BBP中重要挥发性代谢物的分析（Liao等人，2023年；Lin等人，2019年；Zhao等人，2021年）。然而，关于BBP发酵过程中非挥发性物质组成和动态的研究仍然有限。这些非挥发性化合物不仅奠定了BBP的风味基础，还促进了微生物群落的演变（Fang等人，2021年）。此外，一些非挥发性化合物还参与了BBP的生理功能（Varsha等人，2023年；Zhao等人，2022年）。研究较多的非挥发性化合物通常是那些浓度较高或具有潜在危害性的物质，包括氨基酸、有机酸和生物胺（Lin等人，2018年；Luo等人，2023年）。因此，深入研究BBP发酵过程中非挥发性化合物的组成和动态具有重要意义。

在过去的几十年里，基于色谱-质谱技术的分析系统逐渐成为代谢组学研究的核心（Muthubharathi等人，2021年）。代谢组学技术能够鉴定样品中的所有低分子量非挥发性代谢物，广泛应用于环境监测、微生物学、食品等领域（Cho & Peterson，2025年；Fraga-Corral等人，2022年；Xi-wu等人，2020年）。它在阐明发酵食品中代谢物的生化和生物转化过程中发挥了重要作用，有助于揭示食品发酵的机制（Adebo等人，2020年；Chen等人，2024年）。通过对四种印度豆类发酵食品的应用，基因组学和代谢组学方法的结合使用揭示了代谢物在风味形成和生理特性中的作用，其中Bacillus菌株发挥了重要作用（Kharnaior & Tamang，2023年）。在BBP的研究中，Li通过代谢组学方法鉴定了Pixian douban成熟过程中参与风味形成的45种关键代谢物（Li等人，2023年）。代谢组学技术还成功揭示了中国酱油发酵过程中代谢物的动态变化（Chen等人，2024年）。上述研究表明，代谢组学在传统发酵食品研究中具有巨大潜力。

本研究利用UPLC-Q Exactive? HF MS/MS非靶向代谢组学技术揭示了工业发酵过程中BBP中非挥发性代谢物的组成和动态。同时，通过主成分分析（PCA）、OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）和RF（随机森林）等多变量统计分析方法，阐明了关键差异代谢物及其变化趋势。本研究的结果将有助于我们更深入地理解BBP的发酵过程，为生产技术的现代化提供了参考。

部分内容摘录

化学物质与材料

工业BBP样品来自中国云南楚雄的一家知名生产工厂。甲醇（A454-4）和乙腈（A998-4）为分析级，购自Thermo Fisher（美国）。甲酸铵（17843-250克）和甲酸（50144-50毫升）分别购自Honeywell Fluka（美国）和DIMKA（美国）。去离子水由Milli-Q Integral系统（Millipore，美国）制备。内标d₃-Leucine、¹³C₉-Phenylalanine、d5-Tryptophan和^13C₃

工业发酵过程中的理化性质与风味特征

为了监测BBP的发酵过程，测量了PEI_I、PEI_M和PEI_L样品的理化参数、颜色变化及抗氧化特性，并对其风味特征进行了评估。

结论

通过非靶向代谢组学技术揭示了三个工业发酵阶段BBP中非挥发性代谢物的组成。共鉴定出1992种非挥发性代谢物。通过KEGG数据库的整合分析表明，氨基酸代谢（27.94%）和次级代谢物生物合成（14.29%）是主要的代谢途径。在BBP发酵的初期到中期，碳水化合物代谢和氨基酸代谢显著增强。

作者贡献声明

牛成拓：撰写初稿、资金获取、数据分析、概念构思。陈书赫：数据分析。左文军：资源获取。刘春峰：数据可视化、软件处理。李琦：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32472294和32272282）和云南省科学技术厅（编号：202305AF150007）的财政支持。