利用白藜芦醇（Resveratrol）和UVA光实现的光动力灭活作用，用于杀灭食源性病原体

《Food Research International》：Resveratrol mediated photodynamic inactivation using UVA light on foodborne pathogens

　　评估了白藜芦醇介导的365nm UVA光动力灭活对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的协同灭活效果，发现超过5log CFU/ml的抑制率，且后者对UV更敏感，主要ROS为羟基自由基和单线态氧，苹果汁应用显示质量稳定。

　　近年来，食品安全问题在全球食品行业中一直是一个重要挑战，主要原因在于频繁发生的微生物污染事件。尽管食品加工和保存技术取得了显著进展，但由如大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌Typhimurium和李斯特菌monocytogenes等病原体引发的食品安全事件仍持续成为全球范围内的公共卫生问题。消费者对最小化加工食品的需求日益增长，例如新鲜农产品和果汁，这主要源于他们对营养丰富且营养成分损失较少的产品的偏好。然而，最小化加工方式往往缺乏足够的抗菌步骤，增加了食品污染的风险。传统热处理虽然能确保微生物安全，但会导致营养和风味的损失，从而降低产品的可接受性。为应对这些问题，非热处理技术如紫外线（UV）照射因其对多种微生物的高效灭活能力且对食品品质影响较小而受到关注。

尽管UVC通过直接破坏DNA具有强大的杀菌效果，但其在皮肤和眼睛暴露方面的安全问题限制了其应用。因此，研究者开始探索更长波长的区域，如UVA和可见光，作为更安全的替代方案。然而，这些波长的杀菌效果较低，且需要更长的处理时间，这仍然是一个挑战。在此背景下，光动力灭活（PDI）作为一种非热杀菌技术，因其能通过持续生成活性氧物种（ROS）有效控制广泛的微生物而受到重视。PDI的基本机制涉及光敏剂（PS），它们能够吸收光子，激发电子从最高占据分子轨道（HOMO）到最低未占据分子轨道（LUMO），形成电子激发态。在激发状态下，有机光敏剂通过自旋-轨道交叉从单重激发态（1PS*）过渡到三重激发态（3PS*），从而通过两种不同的途径实现微生物灭活：一种是电子转移反应，产生如超氧阴离子、H2O2和羟基自由基（•OH）等ROS；另一种是能量转移反应，生成单线态氧（1O2）。这些ROS在微生物细胞内引发氧化应激，氧化细胞内的蛋白质、脂质和核酸，最终导致微生物死亡。

无机材料如二氧化钛（TiO2）和氧化锌（ZnO）已被证明具有良好的抗菌性能。然而，由于在应用过程中可能产生有毒副产物，它们的生物相容性受到质疑，这限制了其在食品系统中的直接应用。相比之下，来源于天然的有机光敏剂因其良好的安全性、适合直接接触食品以及更高的消费者接受度，成为一种有前景的替代方案。近年来，研究者对多种天然有机化合物，如核黄素、槲皮素、叶酸和咖啡酸，在结合光动力治疗的情况下对抗食品病原体的抗菌潜力进行了研究。因此，PDI作为一种提升最小化加工食品微生物安全性的方法，逐渐受到关注。

本研究探讨了天然多酚白藜芦醇作为食品兼容性光敏剂的潜力，以提高UVA驱动的光动力灭活（PDI）的抗菌效果。白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄和浆果中的多酚化合物，具有抗氧化、抗炎以及对癌症、糖尿病、肥胖和关节炎的治疗作用。白藜芦醇被广泛用作膳食补充剂，每日推荐摄入量可达150毫克，并且适合添加到食品产品中。其中，顺式白藜芦醇在许多植物中存在，是植物作为防御机制对抗有害环境刺激（如真菌或感染）所产生的物质。

此前关于白藜芦醇光动力特性的研究主要集中在ROS的生成及其在医疗领域的应用。白藜芦醇衍生物表现出显著的自旋-轨道交叉和单线态氧生成能力，而UVA照射则通过线粒体途径增强人类角质形成细胞的氧化应激。然而，据我们所知，尚未有研究探讨白藜芦醇在食品病原体上的光动力灭活效果，尤其是在真实食品基质中的应用。因此，本研究评估了白藜芦醇介导的PDI在不同UVA波长（365、385和405纳米）和剂量下的协同抗菌效果，并分析了不同ROS在细菌灭活中的贡献，同时通过碘化丙啶（PI）摄取、细胞内ROS（iROS）和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定验证了其作用机制。此外，本研究还评估了该方法在苹果汁等食品基质中的实际应用，关注其在微生物灭活和果汁品质保持方面的效果。

在实验中，我们选择了三种代表性的食源性病原体作为目标微生物，包括大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌Typhimurium和李斯特菌monocytogenes。实验结果表明，在10 J/cm2的剂量下，365纳米UVA结合100 μM白藜芦醇可实现超过5 log CFU/ml的病原体减少，这一效果显著高于单独使用UVA或白藜芦醇。而在385和405纳米波长下，未观察到类似的增强效果，这表明白藜芦醇的光激活具有波长依赖性。这种协同效应在李斯特菌monocytogenes中尤为明显，相较于大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌Typhimurium，李斯特菌对UV照射的固有抵抗力更高，因此在光动力灭活中表现出更强的反应性。

从作用机制的角度来看，研究发现羟基自由基（•OH）和单线态氧（1O2）是导致细菌灭活的主要ROS，而过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2•-）仅起次要作用。结合处理诱导了显著的细胞膜损伤、细胞内ROS积累以及脂质过氧化，表明氧化应激是微生物灭活的主要机制。在评估该方法在食品中的应用潜力时，我们以苹果汁作为模型食品基质，发现白藜芦醇介导的PDI能够实现接近5 log CFU/ml的微生物减少，而不会影响苹果汁的关键品质属性，包括颜色、pH值和抗氧化活性。这些结果表明，白藜芦醇作为一种天然、有效且无毒的光敏剂，具有在液体食品中应用的潜力。

本研究的实验方法涉及细菌菌株和细胞悬液的制备。大肠杆菌O157:H7（ATCC 43890、ATCC 43889、ATCC 35150）、沙门氏菌Typhimurium（DT104、ATCC 19585、ATCC 43971）和李斯特菌monocytogenes（ATCC 15313，血清型1/2a；ATCC 19111，血清型1/2b；ATCC 19115，血清型4b）均从韩国首尔国立大学食品科学学院的菌种库中获取。将0.7毫升过夜培养的含胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）菌液与0.3毫升50%甘油混合，保存于-80℃。菌株通过胰蛋白胨大豆琼脂平板进行划线接种，以获得均匀的菌落生长。

为了确定在UVA到蓝光波长范围内，哪种波长对白藜芦醇介导的PDI效果最佳，我们研究了白藜芦醇在365、385和405纳米LED光源下的抗菌效果。虽然白藜芦醇在306和320纳米附近具有最大吸收峰，但考虑到其在组织中的穿透深度更大且光毒性较低，我们选择了接近400纳米的波长。在测试的波长中，365纳米UVA结合白藜芦醇表现出最强的协同灭活效果，这可能与该波长下ROS的生成效率更高有关。385和405纳米波长下的效果则相对较低，进一步支持了白藜芦醇光激活对波长的依赖性。

本研究还通过实验验证了白藜芦醇介导的PDI在不同条件下的作用机制。通过碘化丙啶（PI）摄取实验，我们观察到处理后细菌细胞膜的损伤程度显著增加，表明细胞膜是光动力灭活的主要靶标之一。细胞内ROS的积累也进一步支持了ROS在微生物灭活中的关键作用。此外，通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定，我们发现脂质过氧化的水平在处理后明显升高，这表明脂质是另一个受到氧化应激影响的重要细胞成分。这些实验结果共同支持了氧化应激作为微生物灭活主要机制的假设。

在实际应用方面，本研究评估了白藜芦醇介导的PDI在苹果汁中的可行性。实验结果显示，该处理能够有效减少苹果汁中的微生物数量，同时保持其关键品质属性。苹果汁的颜色、pH值和抗氧化活性均未受到明显影响，这表明白藜芦醇介导的PDI在食品应用中具有良好的兼容性。此外，处理后的苹果汁在感官上仍保持良好的可接受性，进一步证明了该方法的实用性。

综上所述，本研究通过实验验证了白藜芦醇作为一种天然、有效的光敏剂在食品应用中的潜力。研究发现，365纳米UVA结合100 μM白藜芦醇能够显著提高对主要食源性病原体的灭活效果，且其作用机制主要涉及羟基自由基和单线态氧的生成，导致细胞膜损伤、细胞内ROS积累以及脂质过氧化。在食品基质中的应用表明，该方法能够在保持食品品质的同时实现有效的微生物控制，为食品工业提供了一种新的非热杀菌策略。