人类NMNAT2的转录调控：来自3D基因组测序和生物信息学的见解

《The FEBS Journal》：Transcriptional regulation of human NMNAT2: insights from 3D genome sequencing and bioinformatics

　　NMNAT2在神经元健康中起关键作用，本研究通过4C-seq技术鉴定其调控区域，发现ATF4、HSF1、SOX11等转录因子在神经元分化过程中抑制NMNAT2表达，并揭示了其三维基因组互作模式与认知功能关联。

　　本研究聚焦于NMNAT2基因的转录调控机制，该基因是合成NAD的关键酶，对神经元健康具有重要作用。在老年人中，NMNAT2的mRNA水平与认知功能呈正相关，但其表达水平会在神经损伤或蛋白病中下降。研究团队利用4C-seq技术（一种结合染色体构象捕获和高通量测序的手段）对NMNAT2的调控区域进行了无偏倚的全基因组识别。通过多种生物信息学分析，研究者不仅发现了与NMNAT2相关的基因，还鉴定了可能的转录因子（TFs）。进一步的生物学验证实验确认了两个特定的基因组区域和四个转录因子（包括ATF4、ATF6α、SOX11和HSF1）在NMNAT2转录中的关键作用。ATF4被发现是与损伤反应相关的转录因子，而HSF1则受到蛋白应激的调控。这些发现表明，不同细胞状态下的NMNAT2调控网络存在显著差异，且这种差异可能与神经元分化过程中调控因子和调控元件的复杂交互有关。

NMNAT2基因的调控网络涉及复杂的基因组结构，包括启动子、增强子和沉默子等。这些调控元件可能位于目标基因的启动子附近，也可能远至数百万个碱基对以外。3D基因组结构使得远距离的调控元件能够与启动子相互作用，从而调控基因表达。当细胞经历分化、信号事件或病理条件时，染色质结构或转录因子的活性可能发生变化，从而改变转录组的景观。例如，在阿尔茨海默病（AD）患者的皮层中，H3K27ac组蛋白修饰模式发生了广泛变化，这种修饰是活跃的增强子标志。轴突切断会通过损伤响应的转录因子引发广泛的基因表达变化。越来越多的文献表明，转录特征与认知功能、脑衰老以及神经退行性疾病中的病理和临床异质性有关。

在本研究中，团队首先通过分析染色质标记（如DNase I超敏反应和H3K4me3）结合ENCODE数据库中的数据，确定了NMNAT2的最小启动子区域为616个碱基对。这一区域位于染色体1上（chr1:183387403–183387601）。接着，研究者利用4C-seq技术对未分化和神经元样状态下的SH-SY5Y细胞（一种人类神经母细胞瘤细胞系）进行了全基因组的交互组捕获。研究发现，这两种细胞状态下的NMNAT2启动子区域与不同的基因组区域相互作用，表明其调控机制存在显著差异。在分化后的细胞中，观察到几乎两倍的染色体内交互组，而染色体间交互组略有减少。研究者还发现，只有两个染色体内和一个染色体间的区域在未分化和神经元样细胞中部分重叠。这一结果表明，不同细胞状态下的NMNAT2调控网络由不同的转录因子和调控元件组成，这种调控变化可能反映了细胞从未分化状态向神经元样状态过渡时，调控元素之间的复杂互动。

为了验证这些调控区域和转录因子对NMNAT2转录的具体作用，研究团队采用基于piggyBac的CRISPR-Cas9基因删除方法，对选定的基因组区域进行删除，并评估其对NMNAT2转录的影响。结果显示，删除区域1（chr1:184664369–184669585）会导致神经元样SH-SY5Y细胞中NMNAT2的表达下调，而删除区域2（chr1:186343515–186346086）则会显著上调未分化细胞中的NMNAT2表达。区域3（chr1:184662408–184664466）作为阴性对照，对NMNAT2的表达没有影响。这些数据不仅确认了区域1和区域2中包含NMNAT2的调控元件，还揭示了在重叠的交互组中可能存在不同的调控元件。

此外，研究者利用GREAT（Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool）工具，分析了与NMNAT2调控相关的基因。在未分化SH-SY5Y细胞中，共识别出39个NMNAT2相关基因，而在神经元样细胞中，这一数字为31个，其中8个基因在两种细胞状态中均出现。这些基因包括EDEM3、C1orf21、TPR、PRG4、ENSG00000173213、USP14、OCLM和ODR4。进一步的分析显示，这些基因在424名ROSMAP研究对象的单核RNA测序（snRNA-seq）数据中与NMNAT2的mRNA水平存在显著相关性，尤其是在兴奋性神经元和抑制性神经元中。例如，AEBP2和ITGB1BP1的表达水平与NMNAT2的mRNA水平呈显著正相关，而RNF2的表达水平则与NMNAT2呈显著负相关。这些结果表明，NMNAT2与这些相关基因之间的表达调控可能是由共同的调控网络驱动的，这些网络可能通过3D基因组结构实现。

为了识别与NMNAT2启动子和交互组相关的转录因子，研究者使用了MEME Suite和WhichTF等工具。MEME Suite分析显示，NMNAT2启动子区域包含50种转录因子的结合位点，其中20种在未分化和神经元样细胞中显著表达。这些转录因子包括ZNF41、REST、MAFF、SOX9、ZBTB6、KLF12、SOX4、ATF4、TCF7、CEBPG、MAFK、VEZF1、NFIC、ETS2、ATF6、RFX3、PATZ1、MAFG、ZNF76和SP4。此外，WhichTF分析显示，有247个功能主导的转录因子在两种细胞状态中均存在，其中14个为未分化细胞特有，11个为神经元样细胞特有。这些结果表明，不同细胞状态下的调控网络存在显著差异，而这种差异可能由特定的转录因子和调控元件介导。

研究者还对ATF4、ATF6、HSF1和SOX11这四个转录因子进行了生物学验证，以确认它们在NMNAT2转录中的作用。结果表明，敲除这些转录因子会导致NMNAT2表达的显著上调，尤其是在未分化细胞中。此外，这些转录因子还影响了与NMNAT2相关的基因，如EDEM3和TPR。例如，在未分化细胞中，ATF4和HSF1的敲除显著提高了TPR的表达，而在神经元样细胞中，ATF4和HSF1的敲除则提高了EDEM3的表达。这些结果支持了这些转录因子作为NMNAT2转录抑制因子的假设，并进一步揭示了它们在调控网络中的核心作用。

研究者还发现，NMNAT2与多个与蛋白稳态相关的基因存在显著的共表达关系，特别是在未分化和神经元样细胞中。ATF4、ATF6和HSF1等转录因子可能通过调控这些基因的表达，影响NMNAT2的转录水平。此外，SOX11也被认为是一个关键的调控因子，其与SOX4的结合位点在NMNAT2启动子区域附近。这些结果表明，NMNAT2的转录调控可能涉及多个不同的转录因子和调控元件，并且这些调控因子可能在不同的细胞状态中发挥不同的作用。

通过4C-seq技术，研究者还发现，未分化和神经元样细胞中NMNAT2启动子区域的交互组存在显著差异。在神经元样细胞中，观察到更多的染色体内交互组，而染色体间交互组则有所减少。这一现象可能反映了细胞在分化过程中，调控元件与启动子之间的3D结构发生了变化，从而增强了NMNAT2的转录。此外，研究者还发现，某些调控区域在两种细胞状态中部分重叠，但其对NMNAT2的调控作用存在差异。这表明，尽管存在一些共同的调控元件，但不同细胞状态下的调控机制仍存在显著差异。

综上所述，本研究通过4C-seq技术系统地鉴定了NMNAT2基因的调控区域和相关的转录因子，揭示了NMNAT2在神经元分化过程中的转录调控机制。研究结果表明，不同细胞状态下的调控网络存在显著差异，这可能与神经元分化过程中调控因子和调控元件的动态变化有关。此外，研究还发现，NMNAT2与多个与蛋白稳态相关的基因存在显著的共表达关系，这为理解NMNAT2在神经退行性疾病中的作用提供了新的视角。这些发现不仅有助于揭示NMNAT2的调控机制，还可能为开发基于NMNAT2的神经保护策略提供理论依据。未来的研究可以进一步探索这些调控因子在不同病理条件下的作用，以及它们如何影响NMNAT2的表达水平和相关基因的调控网络。