利用豌豆蛋白和阿拉伯木聚糖稳定的维生素D3乳液作为植物性饮料的强化策略

《Molecular Nutrition & Food Research》：Vitamin D3 Emulsions Stabilized With Pea Proteins and Arabinoxylans as a Fortification Strategy for Plant-Based Beverages

　　植物基饮料中，豌豆蛋白 isolate（PPI）与玉米阿拉伯木聚糖（CAX）组合作为乳化剂，有效维持维生素 D3 在消化过程中的稳定性和生物可及性，与合成乳化剂 T80相当但更健康可持续。

　　本研究探讨了豌豆蛋白分离物（PPI）和玉米阿拉伯木聚糖（CAX）作为乳化剂在开发富含维生素D3的植物基饮品中的潜力。通过评估这些乳化剂对乳液在消化过程中的结构变化、脂质消化动力学、最终脂质消化率以及维生素D3的生物可利用性的影响，研究旨在为植物基饮品的营养强化提供科学依据。实验中，PPI单独使用或与CAX结合使用（PPI+CAX），而Tween 80作为对照乳化剂。所有乳液均表现出较小的乳滴尺寸（D?,? = 0.57–2.58 μm），表明其具有良好的分散性。当将乳液纳入燕麦奶（OM）中时，乳滴桥接现象减少，从而提高了乳液的胶体稳定性。此外，OM的加入有效防止了乳滴在消化过程中发生融合，这在口腔和胃部消化过程的显微镜图像中得到了验证。然而，PPI和PPI+CAX乳液在OM中的消化速率有所降低，这可能与乳液的结构变化和乳滴的相互作用有关。尽管如此，最终的脂肪酸含量和维生素D3的生物可利用性没有显著差异。这些结果表明，PPI与CAX的组合在开发高效提供维生素D3的植物基饮品方面具有广阔的应用前景。

维生素D3作为脂溶性维生素（FSV）的一种，对于人体的正常发育和健康至关重要。然而，全球范围内存在维生素D3缺乏的情况，特别是在发展中国家，而工业化国家则普遍存在亚缺乏现象。近年来的研究进一步揭示了微量营养素缺乏是全球性问题，估计全球有99.3%的人群至少存在一种微量营养素摄入不足。在欧洲，约有40%–47%的人群被判定为维生素D3缺乏，约13%的人群存在严重缺乏。维生素D3缺乏与慢性或非传染性疾病的增加之间存在因果关系，这使得补充FSV成为一种重要的营养策略。然而，由于饮食限制或个体差异，许多人群无法通过正常饮食满足FSV的需求，因此需要寻找有效的补充方式。

乳化剂和乳液稳定剂在食品工业中被广泛使用，但其对FSV生物可利用性和生物利用度的影响需谨慎考虑。近年来，一些研究表明，传统乳化剂如羧甲基纤维素、聚山梨酯80（即Tween 80）或琼脂糖和胶体物质可能对肠道健康产生负面影响。这些影响不仅在体外和体内实验中被观察到，也在流行病学研究中得到了支持。乳化剂可能通过影响肠道微生物群来间接损害肠道健康。因此，寻找更安全、更有效的乳化剂成为食品营养强化研究的重点。

近年来，许多研究关注了替代乳化剂的乳化性能，包括动物和植物来源的蛋白质、碳水化合物及其组合。这些替代乳化剂可以用于FSV的封装和食品产品的强化。然而，PPI与CAX的组合在FSV输送中的潜力尚未被充分探索。为了填补这一空白，本研究此前探讨了PPI和CAX在维生素E和D3输送中的作用。结果显示，使用PPI和CAX的组合作为乳化剂时，维生素E和D3的生物可利用性与Tween 80相比没有显著差异。这些发现随后在小鼠体内模型中得到了验证，证明PPI和CAX稳定乳液在输送维生素D3方面与Tween 80具有相似的效率。

然而，FSV的生物可利用性高度依赖于其在食品基质中的分布情况。对于饮料而言，FSV的生物可利用性可能受到液体基质中分散性和稳定性的影响。富含FSV的饮料在制作过程中常面临乳液不稳定、不均匀或FSV分散性差等挑战。因此，使用表面活性剂和乳化剂进行稳定化是必要的。本研究的目的是通过使用PPI和CAX或聚山梨酯作为乳化剂，开发富含维生素D3的燕麦基饮品。通过详细表征乳液的物理化学性质，以及评估其在体外消化过程中的脂质消化和维生素D3生物可利用性，研究旨在为植物基饮品的营养强化提供理论支持和实验依据。

实验材料包括PPI（NutralysF85F，最低蛋白含量83%）和CAX（由AgriFiber捐赠）。燕麦奶（YOSOY）是从西班牙本地市场购买的。所有分析试剂均为分析级，购自Sigma-Aldrich。实验中，维生素D3（胆钙化醇）以适当体积的HPLC级乙醇溶液为溶剂，通过氮气蒸发后溶于橄榄油，最终浓度为2 μg胆钙化醇/g橄榄油。随后，通过高速均质化和微流化系统制备了10%（w/w）的油包水（O/W）乳液。乳液的最终胆钙化醇含量为200 ng/mL。在整个实验过程中，乳液被保护免受光照，以防止胆钙化醇降解。

为了评估乳液在消化过程中的行为，实验采用了基于INFOGEST方法的体外静态消化法，并进行了适当修改。具体而言，O/W乳液在消化前被稀释五倍，分别加入燕麦奶或去离子水。样品在持续搅拌下混合5分钟，最终维生素浓度为40 ng/mL。随后，乳液被提交给模拟消化过程，包括口腔（2分钟）、胃部（30分钟）和肠道阶段（2小时），温度保持在37°C。胃部消化时间被缩短至30分钟，因为生理上，液体餐食的消化过程具有快速排空的指数特性。消化过程中使用的酶及其活性分别为：口腔消化阶段使用猪胰腺α-淀粉酶（75 U/mL），胃部消化阶段使用猪胃黏膜胃蛋白酶（2000 U/mL），肠道阶段使用猪胰腺胰蛋白酶（100 U/mL）。此外，在肠道阶段还使用了牛胆汁（10 nmol/mL）。消化液的制备和使用遵循INFOGEST协议。在肠道阶段，通过pH-STAT系统（Titrando 902，Metrohm，瑞士）和TIAMO 2.5监测软件测量游离脂肪酸（FFA）的释放情况。通过测量中和FFA所需的NaOH体积来确定脂质消化的速率和程度。FFA的计算基于实验数据和相应的公式，但研究中未涉及具体的数学表达式。

在消化的每个阶段，均采集样品进行乳滴尺寸和微观结构分析。在肠道阶段结束后，样品经离心（2000 × g，40分钟，10°C）后，上清液通过0.2 μm滤膜（Millipore，马萨诸塞州，美国）过滤。在冷冻保存后，样品用于维生素D3的测量。乳滴尺寸和分布的分析通过静态光散射（SLS）技术进行，使用Mastersizer 3000（Malvern Instruments Ltd，英国）。乳滴尺寸报告为表面加权平均值（D?,?），而乳滴分布则以体积密度（%）表示。橄榄油和水的折射率分别为1.47和1.33。

乳液的微观结构通过Olympus Spectral Confocal显微镜（Olympus FV1000，纽约）进行分析，使用×100油浸物镜。约1 μL乳液被放置在显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖，确保无气泡干扰。图像采集和处理使用Olympus FV10-ASW软件完成。

在体外肠道消化过程中，FFA的释放呈现出双相模式，包括一个快速的初始释放阶段和一个较慢的平台阶段。为了建模这种行为，实验数据被分为两个阶段，并分别应用一阶指数方程进行分析。模型的拟合效果通过R2值和残差图进行评估。实验结果显示，乳液的消化速率和程度在不同条件下存在差异，但最终的FFA释放量在所有条件下均相似。尽管PPI和PPI+CAX在OM中的消化速率有所降低，但其最终的FFA释放量并未显著变化。

维生素D3的生物可利用性分析通过HPLC-MS-MS进行，依据先前发表的协议。简要步骤包括：将500 μL消化液或微胶束相加入血细胞裂解管中，加入20 μL氘代维生素D3的乙醇溶液作为内标，加入480 μL乙醇溶液后，通过两次萃取（每次使用两倍体积的己烷）进行提取。萃取后的上层己烷相在1200 × g，10分钟，4°C的条件下离心后，收集上清液并用氮气蒸发。提取后的胆钙化醇通过加入4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）进行衍生化，随后通过液相色谱-串联质谱（LC–MS2）进行分析，使用Hypersil GOLD C18色谱柱和Thermo Fisher Scientific系统（法国）。数据处理使用Chromeleon 7.2软件完成。胆钙化醇的定量基于其峰面积与保留时间的比例。

统计分析采用至少三个独立数据点进行。数据以均值±标准误（SEM）表示。使用GraphPad Prism软件（版本10.4.0）进行统计分析，除了FFA的数据外。所有数据在进行统计分析前均进行了正态性检验。使用单因素方差分析（ANOVA）进行数据分析，除了乳滴尺寸数据，其使用双因素ANOVA（考虑“条件*消化阶段”）。Tukey检验用于后验分析，以确定均值之间的差异。对于乳滴尺寸数据，进行了成对比较，包括在每个消化阶段内不同条件之间的比较，以及在每个条件内不同消化阶段之间的比较。对于FFA数据，使用JMP Pro 17统计软件（SAS Institute Inc.）进行分析。由于数据分布非正态且各组样本量不等，首先使用Kruskal–Wallis检验（非参数方差分析）进行分析，然后使用Dunn检验进行成对比较以识别特定组间的差异。为控制多重比较的错误发现率（FDR），使用Benjamini–Hochberg方法调整Dunn检验的p值。该方法提供了清晰且简洁的成对比较结果，与Tukey检验在参数分析中的分组系统相似。最终，各组按均值排名，并使用字母系统表示显著差异，字母相同的组之间无显著差异（p > 0.05）。

实验结果显示，当乳液被纳入OM中时，PPI+CAX乳液的桥接絮凝现象减少，从而提高了其胶体稳定性。OM的加入显著降低了PPI+CAX乳液的乳滴尺寸（从2.58 ± 0.25 μm降至0.83 ± 0.02 μm），而T80乳液在OM中的乳滴尺寸变化不明显。显微镜图像支持这些结果，显示PPI+CAX乳液在OM中没有桥接现象，而PPI乳液在OM中仍然存在桥接现象。此外，OM的加入显著减少了PPI和PPI+CAX乳液在口腔和胃部消化阶段的乳滴融合，而T80乳液的乳滴尺寸在消化过程中保持稳定。这可能与OM中的碳水化合物和蛋白质干扰了CAX的吸引力有关，或者增加了连续相的粘度，从而限制了油滴的运动。然而，OM对T80乳液的桥接现象没有显著影响，可能与T80乳液中缺乏蛋白质有关。

在肠道阶段，所有条件下的乳滴尺寸均有所减小，这表明脂质消化已经接近完成。显微镜图像显示，所有条件下的乳滴数量有限，这进一步支持了脂质消化的高效率。尽管PPI和PPI+CAX乳液在OM中的消化速率有所降低，但其最终的FFA释放量和维生素D3的生物可利用性并未受到显著影响。这表明，乳液的结构变化主要影响了消化速率，而非其最终的消化程度。此外，PPI+CAX乳液在所有条件下表现出更高的维生素D3生物可利用性趋势，这可能与CAX的抗氧化能力有关。在胃部消化过程中，由于pH值的降低，维生素D3容易发生异构化，主要转化为异胆钙化醇，这可能引发自氧化反应。CAX可能通过减少乳滴的桥接和絮凝，保护维生素D3免受胃酸环境的影响，从而减少其异构化和降解。此外，CAX的抗氧化能力可能在消化过程中进一步减缓维生素D3的降解。

尽管本研究显示PPI和CAX作为乳化剂在提高维生素D3生物可利用性方面具有潜力，但其对饮品感官特性的影响尚未得到充分研究。这成为本研究的一个局限性，因为感官属性如口感、味道和视觉接受度未被探讨。因此，未来的研究应进一步评估PPI和CAX在植物基饮品中的感官表现，以及它们在提高其他脂溶性维生素（如维生素A、E、K）生物可利用性方面的潜力。

综上所述，PPI与CAX的组合在燕麦奶中能有效稳定乳液，且不会影响维生素D3的生物可利用性，相较于合成乳化剂如聚山梨酯具有优势。这种植物基乳化剂不仅提供了更健康的营养输送方式，还符合可持续发展的食品强化需求。然而，为了全面评估其应用潜力，还需要进一步研究其对饮品感官特性和其他脂溶性维生素输送效果的影响。未来的研究应结合感官分析和多种维生素的生物可利用性评估，以推动植物基饮品的营养强化和健康功能的优化。