Gomesin肽的细胞毒性机制：鞘糖脂通路与胆固醇相互作用的黑色素瘤靶向治疗新策略

《Cell Death Discovery》：The cytotoxicity of gomesin peptides is mediated by the glycosphingolipid pathway and lipid-cholesterol interactions

　　本刊推荐：为克服黑色素瘤BRAFV600E突变患者化疗耐药性问题，研究人员开展蜘蛛源肽Gomesin（AgGom/HiGom）靶向治疗机制研究。通过脂质组学、CRISPR/Cas9筛选及动物实验，首次揭示其通过抑制ST3GAL5基因调控鞘糖脂通路，且胆固醇水平与细胞敏感性呈负相关。该研究为基于脂质代谢的靶向疗法开发提供新方向。

　　

在全球皮肤癌发病率持续攀升的背景下，黑色素瘤作为最具侵袭性的亚型，其BRAF^V600E突变率高达40%-50%。尽管BRAF/MEK靶向疗法和免疫检查点抑制剂取得突破，但毒性反应和耐药性问题仍导致患者预后不佳。自然界生物活性分子为药物研发提供了宝贵资源，其中来自巴西蜘蛛Acanthoscurria gomesiana血细胞的Gomesin肽（AgGom）及其同源物HiGom，因其对黑色素瘤细胞的特异性杀伤能力而备受关注。这些由18个氨基酸组成的β-折叠结构肽，通过二硫键稳定构象，不仅能破坏细胞膜完整性，还能激活细胞内死亡信号通路，但对正常细胞影响较小。然而，其选择性杀伤机制与脂质代谢的关联尚未明确。

为解析Gomesin肽的作用机制，研究团队整合多学科技术方法：通过固相肽合成制备AgGom、HiGom及低毒性变体SpGom；采用MTT法评估细胞活性；利用脂质组学分析黑色素瘤细胞（MM96L）与新生儿包皮成纤维细胞（NFF）的脂质差异；通过电化学阻抗谱（EIS）和钙黄绿素泄漏实验检测模型膜透性；开展全基因组CRISPR/Cas9筛选鉴定关键基因；使用shRNA敲低验证基因功能；最后通过裸鼠异种移植模型进行体内验证。样本来源包括人类黑色素瘤细胞系及原代成纤维细胞。

研究结果

Gomesin肽的特异性抗黑色素瘤活性

浓度反应曲线显示，AgGom和HiGom对MM96L细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）均为9.5μg/mL左右，而对NFF细胞的IC₅₀高达59-71μg/mL，表明其对黑色素瘤细胞的杀伤效力是正常细胞的6-7倍。在多种BRAF^V600E突变黑色素瘤细胞中均观察到增殖抑制现象，且细胞死亡抑制剂实验提示其作用机制涉及多种死亡通路协同作用。

脂质组成差异决定Gomesin敏感性

脂质组学鉴定出1703种脂质分子，其中709种在两组细胞中存在差异。黑色素瘤细胞中中性鞘糖脂含量显著升高，而多不饱和甘油磷脂（如PC 38:4、PS 44:3）和甘油三酯（TG 58:8）水平降低，提示膜流动性差异。关键发现是黑色素瘤细胞总胆固醇含量仅为成纤维细胞的1/3。序列分析显示AgGom和HiGom存在胆固醇识别氨基酸共识序列（CRAC）及其反向结构（CARC），而低毒性的SpGom缺乏该 motif。定点突变实验证实，CRAC结构域中的L5A突变（AgGom_L5A）会显著降低细胞毒性。

胆固醇与磷脂酰丝氨酸（PS）的调控作用

RH421荧光光谱表明，胆固醇比例升高会抑制AgGom与模型膜（POPC:POPS=4:1）的结合，却促进HiGom的结合。电化学阻抗谱显示，胆固醇能减轻两种肽引起的膜破坏程度。在PS富集的膜（POPC:POPS=80:20）中，AgGom和HiGom均引发强烈渗漏，但在胆固醇富集膜（POPC:CHOL=50:50）中无活性。细胞实验验证，添加胆固醇可减弱肽的细胞毒性，而胆固醇螯合剂β-MCD能增强杀伤效果。

CRISPR/Cas9筛选鉴定鞘糖脂通路关键基因

全基因组敲除筛选发现13个显著富集基因（FDR<0.1），其中ST3GAL5和B4GALT5与鞘糖脂代谢相关。通路分析显示唾液酸代谢和糖鞘脂生物合成通路显著富集。shRNA敲低实验证实，抑制ST3GAL5、B4GALT5或UGCG（葡萄糖神经酰胺合成酶）表达会显著降低Gomesin肽的细胞毒性。

体内验证ST3GAL5的核心作用

在ST3GAL5敲低的黑色素瘤异种移植模型中，HiGom（10mg/kg）无法抑制肿瘤生长，而野生型模型中出现显著肿瘤消退（第11天p=0.0296），证实鞘糖脂通路是Gomesin发挥体内抗肿瘤效应的必要条件。

结论与展望

本研究系统阐明了Gomesin肽通过靶向鞘糖脂通路（以ST3GAL5为核心）和胆固醇代谢调控网络实现黑色素瘤特异性杀伤的分子机制。黑色素瘤细胞特有的低胆固醇环境与高鞘糖脂代谢水平，使其对Gomesin肽的敏感性显著高于正常细胞。该发现不仅为理解抗菌肽的选择性抗肿瘤效应提供了新视角，更提出了通过膳食干预（如富含鞘糖脂、低胆固醇饮食）或联合LXRα激动剂（促进胆固醇外排）的协同治疗策略。发表于《Cell Death Discovery》的这项成果，为克服黑色素瘤靶向治疗耐药性开辟了基于脂质代谢重编程的创新路径。