梅花鹿骨肽通过PPAR-γ/Axin2/Wnt信号通路缓解小鼠卵巢切除术引起的骨质疏松症

《Journal of Functional Foods》：Sika deer bone peptide attenuates ovariectomy-induced osteoporosis in mice via PPAR-γ/Axin2/Wnt signaling pathway

　　梅花鹿骨多肽DBP-1-3通过调节骨代谢和抑制PPAR-γ/Axin2通路激活Wnt信号改善骨质疏松小鼠骨微结构，并显著提升血清降钙素、雌激素和1,25(OH)?D?水平。

　　本研究围绕一种从梅花鹿骨中提取的骨肽（DBP-1-3）对骨质疏松症的治疗效果展开。梅花鹿骨作为传统中药的重要组成部分，因其丰富的营养成分和独特的生物活性而受到广泛关注。在本研究中，通过一系列复杂的提取与纯化过程，成功分离出主要由小分子混合肽组成的DBP-1-3，并在实验中观察其对去势导致骨质疏松的小鼠模型的干预效果。研究结果表明，DBP-1-3能够有效改善骨质疏松症状，其作用机制可能与调控骨代谢及增强骨微结构有关，具体表现为通过抑制PPAR-γ/Axin2信号通路并激活Wnt信号通路，从而对骨代谢起到正向调节作用。

### 1. 骨质疏松的病理特征与研究意义

骨质疏松是一种“无声疾病”，其主要特征是骨密度降低和骨微结构改变，导致骨折风险增加。通常情况下，这种疾病在女性中更为常见，尤其是在更年期后，由于雌激素水平下降，骨转换加速，从而增加了骨折的概率。据统计，约有50%的女性在更年期后经历至少一次骨折事件。骨质疏松的发生与骨重塑失衡密切相关，这种失衡可能由多种因素引起，如氧化应激和随后的炎症反应。因此，寻找一种安全、有效的天然疗法，对于缓解骨质疏松具有重要意义。

目前，临床上常用的骨质疏松治疗药物主要包括维生素D钙补充剂、抑制骨细胞破坏的药物以及滋养软骨的药物。然而，这些药物仅能缓解症状，且部分药物在长期使用后可能产生明显的副作用。因此，开发具有预防和治疗作用的天然健康食品成为研究的热点。梅花鹿骨作为一种高营养价值的天然资源，其提取物在促进成骨细胞增殖方面展现出良好的潜力，为研究骨质疏松的天然干预方法提供了新的方向。

### 2. 梅花鹿骨肽的制备与纯化

本研究从梅花鹿的腿部骨骼中提取并纯化出一系列骨肽。首先，将新鲜的梅花鹿骨骼进行清洗、粉碎和去脂处理，随后使用盐酸进行脱钙，以去除钙质并获得蛋白成分。接着，采用水提法，在95°C下进行三次提取，获得粗蛋白提取物。为进一步提纯，使用DEAE-32纤维素离子交换柱层析法进行初步分离，得到两个主要的肽峰（DBP-1和DBP-2）。其中，DBP-1通过进一步的Sephadex G-25脱盐柱层析法处理后，再使用Superdex 30柱进行更精细的分离，最终获得三种不同的肽组分（DBP-1-1、DBP-1-2和DBP-1-3）。通过细胞活力（CCK-8）和碱性磷酸酶（ALP）活性检测，发现DBP-1-3在促进成骨细胞功能方面表现出最强的活性，因此被选为后续实验的重点研究对象。

### 3. DBP-1-3的组成分析

为了进一步了解DBP-1-3的分子组成，研究团队采用毛细管高效液相色谱（HPLC）和电喷雾电离结合轨道阱质谱（LC-MS/MS）技术进行分析。结果显示，DBP-1-3由35种不同的肽组成，其中TPVGGQPSVPGGPVR和GPPGPMGPPGL两种肽因其高丰度和来源于胶原蛋白而引起了研究者的关注。胶原蛋白是骨骼中的主要结构蛋白，其衍生肽在促进骨骼形成方面具有潜在作用。尽管这些肽可能在DBP-1-3中起到关键作用，但其具体功能仍需进一步的实验验证。

### 4. 实验设计与动物模型

本研究采用60只8周龄的雌性ICR小鼠，分为Sham组（假手术组）和Ovx组（去势组）。在实验开始前，所有小鼠均确认其行为正常。Ovx组的小鼠经过去势手术后，其卵巢功能丧失，导致雌激素水平下降，从而模拟更年期后骨质疏松的病理过程。为了进一步评估DBP-1-3的治疗效果，Ovx组又被分为五个子组：Model组（模型组）、Positive组（正药组）以及DBP-1-3低、中、高剂量组（L、M、H）。Sham组和Model组的小鼠每日给予10 mL/kg的蒸馏水，而其他组则根据不同的剂量给予DBP-1-3或正药。

### 5. DBP-1-3对小鼠体重及器官指数的影响

研究结果显示，DBP-1-3对小鼠体重和器官指数的影响较小。尽管所有组的小鼠体重均呈上升趋势，但与Sham组相比，Model组的小鼠体重显著增加（P < 0.05）。在其他组中，体重变化未达到统计学意义（P > 0.05）。此外，DBP-1-3对脑、肝、脾等器官的重量没有显著影响，但对子宫重量的影响较为明显。与Model组相比，DBP-1-3中剂量和高剂量组以及正药组的小鼠子宫重量显著增加（P < 0.01），表明DBP-1-3可能对雌激素水平的调节具有一定的作用。

### 6. DBP-1-3对血清生化指标的影响

血清生化指标分析表明，DBP-1-3能够显著影响多种与骨代谢相关的激素和矿物质水平。与Sham组相比，Model组小鼠的血清钙（Ca2?）水平显著升高（P < 0.05），而血清降钙素（CT）和1,25(OH)?D?水平显著降低（P < 0.01）。这可能与去势后雌激素水平下降导致的骨吸收增强有关。然而，在DBP-1-3干预后，这些指标得到了一定程度的改善。例如，与Model组相比，DBP-1-3中剂量和高剂量组以及正药组的小鼠血清CT和1,25(OH)?D?水平显著上升（P < 0.01），而Ca2?水平则显著下降（P < 0.05）。这种变化可能与DBP-1-3对钙平衡的调节作用有关。

### 7. DBP-1-3对骨微结构的影响

通过微CT分析，研究团队评估了不同处理组小鼠的骨微结构变化。结果显示，与Sham组相比，Model组小鼠的骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）显著下降，而骨小梁分离度（Tb.Sp）显著上升。这些变化表明，去势导致了骨微结构的破坏。然而，在DBP-1-3干预后，这些参数得到了显著改善。特别是高剂量组，其BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著上升（P < 0.05），而Tb.Sp和骨表面面积/骨体积比（BS/BV）则显著下降（P < 0.05）。这表明DBP-1-3可能通过促进骨形成并抑制骨吸收，从而改善骨微结构。

### 8. DBP-1-3对骨组织病理变化的影响

通过苏木精-伊红（HE）染色分析，研究团队进一步评估了DBP-1-3对骨组织形态的影响。结果显示，与Sham组相比，Model组小鼠的骨小梁数量减少，骨小梁断裂，骨髓腔扩大，且脂肪细胞增多。这些病理特征与骨质疏松的典型表现一致。然而，在DBP-1-3干预后，尤其是高剂量组，这些变化得到了明显改善。骨小梁数量增加，骨小梁结构更加紧密，且脂肪细胞数量减少，显示出与Sham组相似的正常骨组织特征。这表明DBP-1-3可能通过促进骨形成和抑制骨吸收，改善骨组织的病理状态。

### 9. DBP-1-3对PPAR-γ、Axin2和β-catenin蛋白表达的影响

进一步的蛋白质表达分析表明，DBP-1-3能够显著下调PPAR-γ和Axin2的表达，同时上调β-catenin的表达。PPAR-γ是成骨细胞分化和功能的重要调节因子，其过度激活可能导致骨吸收增加。而Axin2作为Wnt信号通路中的负调控因子，其表达水平的下降可能促进Wnt信号通路的激活。β-catenin则是Wnt信号通路中的核心成分，其表达的增加可能增强成骨细胞的分化和增殖能力。因此，DBP-1-3可能通过抑制PPAR-γ/Axin2通路并激活Wnt信号通路，从而改善骨代谢失衡，发挥抗骨质疏松的作用。

### 10. DBP-1-3的作用机制与研究意义

综上所述，DBP-1-3可能通过多条信号通路协同作用，改善骨质疏松症状。其作用机制可能包括：通过促进钙吸收和抑制钙流失，调节血清钙水平；通过增强降钙素（CT）和1,25(OH)?D?的分泌，促进成骨细胞的活性和骨形成；通过抑制PPAR-γ和Axin2的表达，促进Wnt信号通路的激活，从而改善骨代谢失衡。此外，DBP-1-3还可能通过调节雌激素水平，间接影响骨吸收和骨形成过程。

本研究的发现为开发天然抗骨质疏松药物提供了新的思路。尽管目前尚未完全明确DBP-1-3的具体作用靶点，但其在改善骨微结构和调节骨代谢方面的潜力值得进一步研究。未来的研究可以集中在合成特定肽并评估其对成骨细胞和破骨细胞的具体作用，以进一步明确其药理机制。此外，还可以探索DBP-1-3在其他骨代谢相关疾病中的应用，如骨质疏松症、骨坏死等。这将有助于推动天然药物在骨代谢领域的应用，为临床提供更安全、有效的治疗方案。