通过整合的计算机模拟（in silico）和体外实验（in vitro）方法，从蛋壳膜水解物中鉴定出具有新型伤口愈合潜力的肽，并探究其分子机制

《Journal of Functional Foods》：Identification and molecular mechanisms of novel wound healing potential peptides from eggshell membrane hydrolysates assisted by an integrated in silico and in vitro approach

　　鸡壳膜水解物中新型多肽的抗氧化活性及伤口愈合机制研究。通过蛋白酶解筛选出 papain 水解物（PapH）最佳活性，鉴定出三肽（P1、P2、P3），其中 P1 通过特异性结合 Keap1 激活 Nrf2/HO-1 通路，显著提升 L929 细胞迁移和伤口愈合率。研究为废弃鸡壳膜高值化利用提供理论支持。

　　本研究聚焦于从新鲜鸡蛋蛋壳膜（ESM）中提取并合成新型肽类物质，以探索其在促进伤口愈合中的潜力及作用机制。蛋壳膜作为蛋壳的一部分，通常被视作废弃物，但其富含蛋白质，具有潜在的生物活性。近年来，随着对天然产物中活性成分的研究不断深入，人们逐渐意识到，蛋壳膜中可能蕴含着具有重要生物功能的肽类物质。因此，本研究通过整合计算机模拟与体外实验的方法，系统评估了从蛋壳膜中提取的肽类物质的抗氧化和伤口愈合能力，同时揭示了其可能的作用机制。

### 蛋壳膜的生物活性与研究背景

皮肤作为人体的重要屏障，不仅抵御外部病原体的侵入，还承担着维持整体健康的重要职责。然而，当皮肤受到创伤、烧伤或手术等外界因素影响时，其完整结构和屏障功能可能会受到破坏，从而导致伤口的形成。根据伤口的性质，可分为急性和慢性两类，其中慢性伤口因无法有效愈合而对患者和整个社会造成更大的健康和经济负担。目前，用于治疗伤口的传统药物如抗生素、清创药物、降糖药物及血管扩张剂等，不仅成本较高，而且其疗效有限，且容易导致药物耐受性的产生。因此，开发新型的治疗策略对于伤口管理具有重要的现实意义。

在这一背景下，肽类物质因其多样化的生物活性而逐渐成为伤口治疗领域的研究热点。伤口修复过程是一个复杂且多阶段的动态过程，通常包括止血、炎症、增殖和重塑四个阶段。其中，炎症阶段由活性氧（ROS）调控，ROS的过量产生会破坏细胞结构，延长炎症过程，进而影响伤口的愈合。因此，抗氧化能力在伤口治疗中显得尤为重要。已有研究表明，外源性抗氧化剂通过调节信号通路如IKKα/β/NF-κB、PI3K/AKT和MAPK级联反应，从而促进伤口愈合。例如，黑米提取物因其抗氧化特性在伤口治疗中表现出积极作用；尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）皮肤水解物也显示出促进伤口愈合的潜力，而壁虎源的抗菌肽则有助于皮肤修复。因此，抗氧化肽被视为一种有前景的治疗策略，用于增强伤口修复效果。然而，目前对于氧化应激如何抑制成纤维细胞迁移的具体机制尚不明确。

### 蛋壳膜的组成与潜在价值

蛋壳膜不仅是一种高营养价值的蛋白质来源，还可能在食品工业和生物医学领域中发挥重要作用。据研究，蛋壳膜含有88–96%的蛋白质，包括胶原蛋白（I型、V型和X型）、骨桥蛋白、角蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白等。这些成分赋予了蛋壳膜一定的结构稳定性和生物活性。因此，从蛋壳膜中提取具有生物活性的肽类物质，不仅有助于提高蛋壳膜的附加值，还为开发新型治疗产品提供了可能。

此外，蛋壳膜水解物在多个方面表现出良好的生物活性。例如，研究发现，将蛋壳膜水解物添加到NHEK-Neo细胞中，能够显著提升角质形成细胞的分化标记物表达，表明其在改善皮肤老化方面具有积极作用。然而，尽管许多研究利用全层皮肤伤口模型证实了蛋壳膜粉末或其水解物对伤口愈合的促进作用，但其具体的作用机制仍未完全阐明。因此，进一步研究蛋壳膜水解物的生物活性及其作用机制，对于其在伤口治疗中的应用具有重要意义。

### 蛋壳膜水解物的提取与鉴定

为了从蛋壳膜中提取具有生物活性的肽类物质，研究采用了多种蛋白酶进行水解，包括胃蛋白酶（PepH）、碱性蛋白酶（AlkH）、木瓜蛋白酶（PapH）和中性蛋白酶（NeuH）。这些蛋白酶的水解效率对最终提取的肽类物质的活性具有重要影响。研究发现，木瓜蛋白酶（PapH）水解所得的蛋壳膜水解物在抗氧化和伤口愈合方面表现出最强的活性，这表明其在释放具有生物活性的肽类物质方面具有优势。此外，研究还发现，尽管某些蛋白酶组合可能提高水解效率，但大多数情况下，单一蛋白酶的水解效果更优，且某些组合甚至会显著降低活性肽的产量。

为了进一步鉴定具有生物活性的肽类物质，研究采用了一种整合的肽组学分析方法，结合计算机模拟与体外实验，筛选出具有较高生物活性的肽类物质。通过分析，研究发现，木瓜蛋白酶水解所得的肽类物质在抗氧化和伤口愈合方面表现最佳，其中三种新型肽类物质KDFPCPM（P1）、DKDGPFRLC（P2）和LVEKGDVAF（P3）被识别为具有重要生物活性的候选肽。这些肽类物质不仅表现出优异的抗氧化能力，还在促进细胞迁移方面表现出显著效果，从而增强伤口愈合能力。

### 抗氧化与伤口愈合机制的探索

研究通过体外实验进一步验证了这些肽类物质的抗氧化与伤口愈合能力。例如，在H?O?诱导的L929细胞中，这些肽类物质显著提高了细胞的存活率，并调节了超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的水平，表明其能够有效减轻氧化应激对细胞的损伤。此外，通过划痕实验，研究发现这些肽类物质能够显著促进L929细胞的迁移，从而加速伤口愈合。特别是P1，其促进伤口愈合的能力超过了P2和P3。

进一步的研究通过蛋白质组学和分子对接技术揭示了P1促进伤口愈合的潜在机制。蛋白质组学分析表明，P1能够显著调节与伤口修复相关的蛋白质表达，包括Nrf2和HO-1。分子对接实验则显示，P1能够与Keap1形成稳定的结合，从而激活Keap1介导的Nrf2/HO-1信号通路，提高细胞的抗氧化防御能力。这一发现为理解P1在促进伤口愈合中的作用机制提供了重要线索。

此外，研究还探讨了这些肽类物质在体外模拟胃肠道消化过程中的稳定性。结果显示，尽管这些肽类物质在消化后仍表现出一定的抗氧化和促进伤口愈合的能力，但其活性较原物质有所下降。这表明，在实际应用中，可能需要对这些肽类物质进行化学修饰，以提高其在体内的稳定性和生物利用度。

### 生物活性肽的筛选与合成

为了进一步验证这些肽类物质的生物活性，研究采用了化学合成的方法，通过固相合成技术制备了P1、P2和P3。合成的肽类物质具有良好的水溶性和纯度，且通过高效液相色谱（HPLC）和质谱分析验证了其纯度不低于96%。这些合成肽类物质不仅表现出优异的抗氧化能力，还在促进细胞迁移方面显示出显著效果。

为了评估这些肽类物质的潜在应用价值，研究还对其毒性、致敏性、水溶性和稳定性进行了预测分析。结果显示，这些肽类物质在大多数情况下均表现出非毒性、非致敏性和良好的水溶性，且具有较高的稳定性。这些特性表明，这些肽类物质在作为药物或功能性食品成分时具有较大的应用潜力。

### 结论与展望

本研究不仅揭示了从蛋壳膜中提取的新型肽类物质在促进伤口愈合中的作用机制，还为蛋壳膜的高附加值利用提供了新的思路。此外，研究还强调了这些肽类物质在减轻环境负担方面的潜在价值，因为蛋壳膜的处理通常采用低价值方式，如直接丢弃或用作动物饲料。而通过提取和合成具有生物活性的肽类物质，可以有效提高其利用价值。

然而，尽管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。例如，虽然已经初步揭示了P1通过激活Keap1-Nrf2-HO-1信号通路促进伤口愈合的机制，但具体的作用细节仍需进一步研究。此外，由于这些肽类物质在体外实验中表现出良好的活性，但其在体内应用中的效果仍需通过动物模型进行验证。因此，未来的研究可以进一步探索这些肽类物质在体内环境中的行为，以及它们如何通过多种机制协同作用，实现更有效的伤口修复。

总的来说，本研究通过系统的方法，揭示了从蛋壳膜中提取的新型肽类物质在促进伤口愈合中的潜力及其作用机制，为开发新型治疗策略提供了理论基础和技术支持。这些成果不仅有助于提高蛋壳膜的利用价值，也为解决慢性伤口问题提供了新的思路。