TGFβ-Smad3信号通路通过调控Srsf1介导的纤连蛋白剪接恢复衰老骨骼肌干细胞功能

《Nature Communications》：TGFβ-Smad3 signaling restores cell-autonomous Srsf1-mediated splicing of fibronectin in aged skeletal muscle stem cells

　　骨骼肌衰老伴随再生能力下降，但其机制尚不明确。本研究揭示肌肉干细胞（MuSC）通过TGFβ1-Smad3-Srsf1通路自分泌含EDB结构域的纤连蛋白（EDB(+) FN）的重要作用。研究人员发现衰老导致该通路失调，而适时激活TGFβ1信号可恢复老年小鼠MuSC的增殖能力和肌肉修复，为对抗少肌症提供了新靶点。

　　

随着人口老龄化加剧，少肌症（sarcopenia）已成为影响老年人生活质量的重要健康问题。这种以骨骼肌质量、力量和功能进行性丧失为特征的疾病，其背后隐藏着一个关键谜题：为什么随着年龄增长，肌肉的自我修复能力会显著下降？骨骼肌干细胞（Muscle stem cells, MuSCs）作为肌肉再生的主要执行者，其功能衰退被认为是核心原因之一。虽然研究表明MuSCs所处的微环境（niche）在衰老过程中发生显著改变，但细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分如何特异性调控干细胞行为的分子机制仍不清晰。

近日，发表于《Nature Communications》的一项研究揭开了这一谜题的关键层面。由C. Florian Bentzinger团队领衔的研究发现，肌肉干细胞通过自分泌一种特殊的纤连蛋白（fibronectin, FN）剪接变体来维持自身功能，而这一精密调控机制在衰老过程中被破坏，导致肌肉再生能力下降。

研究人员首先通过单细胞测序分析发现，激活状态的MuSCs特异性地表达含有EDB额外结构域的纤连蛋白（EDB⁽⁺⁾ FN），而其他细胞类型如纤维脂肪组祖细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）则几乎不表达这种变异体。这种EDB⁽⁺⁾ FN在肌肉干细胞微环境中的富集提示了其可能具有独特的调控功能。

为了验证这一假设，团队设计了一系列精巧的实验。他们发现，与不含EDB结构域的FN相比，EDB⁽⁺⁾ FN能显著促进MuSC来源的成肌细胞增殖。相反，特异性敲低EDB⁽⁺⁾ FN（而非其他FN异构体）会严重损害成肌细胞增殖和肌肉再生，模拟了衰老表型。

机制探索表明，丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子1（serine/arginine-rich splicing factor 1, Srsf1）是调控EDB外显子包含的关键因子。生物信息学分析显示，FN pre-mRNA的EDB外显子中存在两个保守的GA丰富外显子剪接增强子（exonic splicing enhancers, ESEs） motif，分子对接模拟证实Srsf1的RNA识别模体（RNA recognition motifs, RRM）与这些motif具有强相互作用。

进一步研究发现，TGFβ-Smad3信号通路位于Srsf1的上游。染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）实验证实磷酸化Smad3（p-Smad3）可直接结合Srsf1启动子区域。在衰老肌肉中，Srsf1和EDB⁽⁺⁾ FN表达显著降低，同时MuSC中激活态整合素β1（activated integrinβ1）水平下降。

最令人振奋的是，研究人员发现适时、瞬时的TGFβ1处理可恢复老年小鼠MuSC中Srsf1和EDB⁽⁺⁾ FN表达，改善肌肉再生，且不会加剧纤维化。这一发现为开发针对少肌症的再生疗法提供了新思路。

关键技术方法方面，研究结合了单细胞测序数据挖掘、体外细胞共培养模型、基因敲低、小鼠肌肉损伤模型、蛋白质组学分析和分子对接模拟等多种技术手段。人类骨骼肌样本来自14-26岁患者的膝关节手术剩余组织。

EDB⁽⁺⁾ FN是激活MuSC的特异性ECM标志物

通过分析单细胞测序数据，研究人员发现静止期MuSC不表达FN，而损伤后5天，MuSC和FAPs均表达FN。值得注意的是，EDB⁽⁺⁾ FN在激活的MuSC来源成肌细胞中高表达，而在FAPs中几乎检测不到。免疫染色证实，损伤后24小时，91%的EDB⁽⁺⁾ FN与M-Cad阳性MuSC共定位，表明EDB⁽⁺⁾ FN是激活MuSC的特异性ECM标志物。

自调节性EDB⁽⁺⁾ FN为增殖MuSC所必需

功能实验表明，表达EDB⁽⁺⁾EDA^(-) FN的细胞外基质能显著促进Pax7-zsGreen成肌细胞增殖。特异性敲低EDB⁽⁺⁾ FN（而非EDB^(-) FN）会严重损害小鼠和人类成肌细胞增殖，减少Pax7和Ki67阳性细胞比例。在单根肌纤维培养模型中，敲低EDB⁽⁺⁾ FN同样显著降低每个克隆簇中的Pax7阳性MuSC数量。

EDB⁽⁺⁾ FN缺失损害体内肌生成

在体实验中，自递送siEDB⁽⁺⁾ FN处理导致年轻小鼠肌肉再生受损，新形成的eMyHC阳性肌纤维横截面积减小，Pax7阳性MuSC数量减少62%，模拟了衰老肌肉的特征性改变。

EDB剪接受Srsf1调控

研究人员在FN EDB外显子中发现两个保守的GA丰富ESE motif，分子对接显示Srsf1 RRM结构域与5'-AGGAGAAG-3'序列有大量非共价相互作用。敲低Srsf1显著降低EDB外显子包含率，而过表达Srsf1则增加EDB包含。FN minigene实验进一步证实Srsf1对EDB剪接的直接调控作用。

Smad3控制Srsf1和EDB⁽⁺⁾ FN表达

启动子分析发现Srsf1上游存在高度保守的Smad3结合位点。ChIP实验证实p-Smad3可直接结合该区域。Smad3抑制剂SIS3处理以剂量依赖方式降低Srsf1和EDB⁽⁺⁾ FN表达，并减少成肌细胞增殖。这些效应在人类成肌细胞中得到验证。

自调节性EDB⁽⁺⁾ FN刺激整合素信号和肌源性祖细胞增殖

蛋白质组学分析显示，敲低EDB⁽⁺⁾ FN影响细胞周期和ECM-受体相互作用通路。EDB⁽⁺⁾ FN敲低导致激活态整合素β1水平降低57%，而在整合素β1敲除成肌细胞中，siEDB⁽⁺⁾ FN不再影响细胞数量，表明EDB⁽⁺⁾ FN通过整合素发挥功能。

瞬时TGFβ1信号恢复衰老MuSC中Srsf1和EDB⁽⁺⁾ FN表达

衰老小鼠肌肉中Srsf1和EDB⁽⁺⁾ FN表达分别降低44%和58%。损伤后1天单次注射TGFβ1可增加老年肌肉中Srsf1（66%）和EDB⁽⁺⁾ FN（263%）表达，提高MuSC中激活态整合素β1水平（201%），改善肌肉再生，增加Pax7阳性MuSC数量（89%），同时降低胶原I沉积（33%）和间质细胞数量（35%）。30天后评估未发现长期不良反应。

该研究首次揭示了MuSC通过TGFβ1-Smad3-Srsf1通路自分泌EDB⁽⁺⁾ FN的精密调控机制，并证实这一机制在衰老过程中的失调是导致肌肉再生能力下降的关键因素。更重要的是，研究证明适时激活TGFβ信号可恢复老年干细胞功能，为开发针对年龄相关性肌肉衰退的再生疗法提供了新靶点。由于EDB⁽⁺⁾ FN等ECM分子本身难以直接应用，针对其上游调控通路（如TGFβ-Smad3-Srsf1轴）进行干预可能更具临床可行性。这些发现不仅深化了对肌肉干细胞微环境调控的理解，也为对抗少肌症等年龄相关性肌肉疾病开辟了新途径。