基于结构基因组变异快速分子鉴别养殖红鳍东方鲀的创新方法及其在食品安全中的应用

《Applied Biological Chemistry》：Rapid molecular authentication of cultured Takifugu rubripes using structural genomic variations

　　本研究针对养殖与野生红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）及其近缘有毒物种难以准确鉴别的问题，开发了基于结构基因组变异（SVs）的分子诊断技术。研究人员通过比较基因组分析鉴定出226个大于1 kb的大片段缺失，筛选出6个在养殖群体中稳定扩增的缺失标记（Ch1-5、Ch9-1、Ch18-9、Ch20-1、Ch20-4、Ch20-13），并建立多重超快实时PCR（ultrafast real-time PCR）检测体系，可在30分钟内实现准确鉴别。该技术为河豚贸易中TTX（tetrodotoxin）安全风险管控提供了高效可靠的分子溯源方案，对保障全球水产品安全具有重要意义。

　　

在东亚美食文化中，河豚以其独特的鲜美口感备受推崇，但其中含有的河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）却可能引发严重的食物中毒事件。红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）作为重要的经济物种，其养殖个体因投喂无TTX饲料而基本不含毒素，而野生个体则可能通过食物链积累TTX，存在较高安全风险。然而，红鳍东方鲀与伪纹东方鲀（T. pseudommus）、中国东方鲀（T. chinensis）等近缘物种形态相似、遗传背景高度一致，传统形态学与常规分子标记（如COI、Cytb、16S rRNA）难以实现准确鉴别，导致市场上常出现物种误标、养殖产品冒充野生等乱象，严重威胁消费者安全与行业监管。

为解决上述问题，Kim等人在《Applied Biological Chemistry》上发表研究，开发了一种基于结构基因组变异（structural genomic variations）的快速分子鉴别方法。该研究通过比较野生伪纹东方鲀与红鳍东方鲀参考基因组（fTakRub1.2），筛选出在养殖红鳍东方鲀中特异性存在的大片段缺失（>1 kb），并利用PCR技术实现对其养殖身份的快速、准确鉴别。

在研究过程中，作者首先采集了来自韩国、日本和中国的养殖红鳍东方鲀样本（n=68）以及野生红鳍东方鲀、伪纹东方鲀和中国东方鲀商业样本（n=29）。通过比较基因组学分析，从226个候选大片段缺失中筛选出8个在养殖群体中稳定扩增的标记。进一步验证后，最终确定6个缺失标记（Ch1-5、Ch9-1、Ch18-9、Ch20-1、Ch20-4、Ch20-13）能够特异性区分养殖与野生个体。此外，研究还发现养殖群体在TP7-1简单序列重复（SSR）位点上的等位基因多样性显著低于野生群体，进一步支持了养殖群体遗传背景的一致性。为提升检测效率，作者进一步开发了多重超快实时PCR技术，可在30分钟内完成检测，并利用熔解曲线分析确保结果特异性。

主要技术方法概述

本研究采用酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，通过比较基因组学筛选结构变异标记，利用常规PCR与微芯片电泳技术验证缺失标记的扩增特性，并基于超快实时PCR平台建立多重检测体系。样本包括韩国、日本和中国的养殖红鳍东方鲀以及野生近缘物种商业样本，所有样本经DNA条形码与形态学鉴定确认物种身份。

遗传多样性分析结果

通过对TP7-1 SSR位点的基因分型分析，发现养殖韩国红鳍东方鲀群体的等位基因数（N_A=3）和基因型数（N_G=4）显著低于野生群体（N_A=14, N_G=28），但观察杂合度（H_O=0.920）高于野生群体（H_O=0.744）。序列分析显示，养殖韩国群体TP7-1位点主要长度为294 bp（82%）和292 bp（18%），而日本养殖群体均为332 bp，野生中国东方鲀群体则呈现275 bp、305 bp、325 bp和345 bp等多种等位基因。这一结果说明养殖群体由于人工选育和隔离繁殖，遗传多样性降低，为区分养殖与野生群体提供了遗传学依据。

缺失标记验证结果

通过常规PCR对8个候选缺失标记（Ch1-5、Ch3-15、Ch6-6、Ch9-1、Ch18-9、Ch20-1、Ch20-4、Ch20-13）进行验证，发现其中6个标记（Ch1-5、Ch9-1、Ch18-9、Ch20-1、Ch20-4、Ch20-13）在全部养殖样本中均能稳定扩增，而在野生样本中则表现为不扩增或随机扩增。灵敏度实验表明，这些标记的检测限在0.01–0.1 ng/μL之间，其中Ch20-1和Ch20-4的灵敏度最高（0.01 ng/μL）。中国养殖样本的验证结果进一步支持了这6个标记在东亚养殖群体中的普适性。

多重超快实时PCR检测体系的建立

作者选取位于不同染色体上的4个缺失标记（Ch1-5、Ch9-1、Ch18-9、Ch20-1）和1个阳性内参（Takifugu COI通用引物），在10孔芯片上建立多重超快实时PCR体系。结果显示，养殖红鳍东方鲀样本在所有标记中均出现特异性扩增曲线和熔解峰（T_M值为79.06–83.86°C），而野生样本仅在COI内参和部分标记中扩增。该体系可在30分钟内完成检测，且重复性良好，C_q值稳定在17.39–25.23之间。

研究结论与意义

本研究首次利用结构基因组变异中的大片段缺失作为分子标记，实现了养殖红鳍东方鲀与野生近缘物种的快速、准确鉴别。所开发的6个缺失标记具有高度的养殖群体特异性，且适用于多重超快实时PCR平台，显著提升了检测效率。这一技术不仅为解决河豚产品溯源难题提供了可靠工具，也为其他水产物种的养殖与野生鉴别提供了方法学参考。此外，研究结果从遗传学角度证实了养殖群体与野生群体在基因组结构上的显著差异，为理解人工选育对物种遗传背景的影响提供了重要依据。该技术的推广应用将有助于加强河豚贸易的监管，降低TTX中毒风险，保障全球水产品供应链的安全性与可追溯性。