瘤胃微生物紊乱通过激活氧化应激和铁蛋白自噬-铁死亡诱导奶山羊乳腺炎

《iScience》：Ruminal microbial dysbiosis induces mastitis in dairy goats by activating oxidative stress and ferritinophagy-ferroptosis

　　本研究针对高精料饮食诱发反刍动物乳腺炎的机制难题，揭示了瘤胃微生物紊乱通过升高LPS水平，激活氧化应激和铁蛋白自噬-铁死亡通路，最终导致乳腺屏障破坏和炎症发生。研究人员通过动物模型、瘤胃微生物移植和细胞实验，证实铁死亡抑制剂Fer-1可有效缓解乳腺炎，为靶向干预提供了新策略。

　　

在追求高产奶量的现代畜牧业中，养殖户常常通过增加精料比例来提高反刍动物的产奶性能。然而，这种高精料（HC）饮食就像一把双刃剑，在提升产量的同时，也埋下了健康的隐患。长期饲喂高精料容易导致亚急性瘤胃酸中毒（SARA），引发瘤胃微生物群落紊乱，进而诱发一系列代谢性疾病，其中乳腺炎尤为突出。乳腺炎不仅造成巨大的经济损失，还严重威胁乳制品安全。尽管此前研究提示瘤胃微生物紊乱与乳腺炎发生存在关联，但背后的具体机制仍是一个未解之谜。

在这项发表于《iScience》的研究中，何玉红、张伟等研究人员深入探索了高精料饮食诱导奶山羊乳腺炎的新机制。他们发现，这条通路的关键在于“氧化应激”和“铁死亡”这两个细胞生物学事件。铁死亡是2012年才被明确的一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的细胞死亡方式，其核心特征包括谷胱甘肽（GSH）耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达下降、铁离子累积和脂质过氧化物堆积。

为了揭示这一机制，研究团队设计了一系列严谨的实验。首先，他们用高精料饮食饲喂奶山羊8周，成功建立了SARA模型。随后，他们通过瘤胃微生物移植（RMT）技术，将奶山羊的瘤胃微生物群落“复制”到经过抗生素预处理的小鼠体内，以验证瘤胃微生物与乳腺炎的因果关系。在细胞层面，他们使用脂多糖（LPS）刺激小鼠乳腺上皮细胞（MMECs），模拟体内高LPS环境对乳腺细胞的影响。此外，研究还采用了16S rRNA测序分析瘤胃微生物组成，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹（Western blot）、组织化学染色等技术检测炎症指标、氧化应激指标、铁死亡相关蛋白表达以及血乳屏障（BMB）完整性。

高精料饮食诱导奶山羊乳腺炎

研究人员将奶山羊分为低精料（LC）组和高精料（HC）组，饲喂8周。结果显示，HC组奶山羊瘤胃pH长时间低于5.8，成功诱导SARA。与LC组相比，HC组奶山羊乳腺组织出现明显的炎症细胞浸润和上皮损伤，乳汁体细胞数（SCC）显著升高（超过50万/mL），表明发生了乳腺炎。同时，HC组奶山羊血清和乳腺组织中的LPS、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）水平显著升高，髓过氧化物酶（MPO）活性增强，而紧密连接蛋白（TJs）如ZO-1、Occludin和Claudin-3的表达则显著降低，说明血乳屏障遭到破坏。

高精料饮食诱导奶山羊瘤胃微生物紊乱

通过对瘤胃微生物进行16S rRNA测序分析，发现HC组奶山羊瘤胃微生物的Shannon多样性指数降低，Simpson指数升高。主坐标分析（PCoA）显示LC组和HC组瘤胃微生物结构存在显著差异。在属水平上，HC组中Rikenellaceae_RC9_gut_group和norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group等菌群的丰度显著降低，而Acetitomaculum、Christensenellaceae_R-7_group和Olsenella等菌群的丰度则升高。相关性分析表明，这些在HC组中富集的菌群与乳腺炎症指标呈正相关，与血乳屏障功能指标呈负相关。

瘤胃微生物移植来自高精料奶山羊可诱导小鼠乳腺炎

为了证实瘤胃微生物紊乱与乳腺炎之间的因果关系，研究人员进行了瘤胃微生物移植实验。他们将HC组和LC组奶山羊的瘤胃微生物移植给经抗生素预处理的小鼠。结果发现，移植了HC组瘤胃微生物的小鼠（Abx+RMTHC组）乳腺组织出现了严重的炎症细胞浸润和腺泡结构破坏，炎症评分、TNF-α、IL-1β浓度和MPO活性均显著升高，乳腺组织LPS水平升高，同时紧密连接蛋白表达下降。而移植LC组瘤胃微生物的小鼠（Abx+RMTLC组）则未出现上述明显炎症现象。这表明HC饮食导致的瘤胃微生物紊乱是诱发乳腺炎的直接原因。

高精料饮食诱导奶山羊乳腺组织氧化应激和铁死亡

研究人员进一步探讨了HC饮食诱发乳腺炎的细胞机制。他们发现，与LC组相比，HC组奶山羊乳腺组织中的抗氧化能力下降，表现为过氧化氢酶（CAT）活性和GSH含量显著降低。同时，铁死亡的关键指标出现异常：铁离子（Fe、Fe²⁺）和丙二醛（MDA）含量升高，铁蛋白重链（FTH）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和GPX4蛋白表达下调，而环氧化酶2（Cox2）表达上调。同样，在移植了HC组瘤胃微生物的小鼠乳腺组织中，也观察到了类似的氧化应激和铁死亡特征。这些结果提示，HC饮食通过引起瘤胃微生物紊乱，激活了乳腺组织的氧化应激和铁死亡通路。

Fer-1缓解由高精料奶山羊瘤胃微生物移植引起的小鼠乳腺炎

铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）能否缓解乳腺炎？研究人员在给小鼠移植HC组瘤胃微生物前，预先注射Fer-1。结果显示，Fer-1预处理显著减轻了小鼠乳腺组织的炎症细胞浸润，降低了炎症评分、TNF-α、IL-1β水平和MPO活性，同时恢复了抗氧化酶（SOD、CAT）活性和GSH含量，降低了MDA水平。更重要的是，Fer-1预处理还逆转了紧密连接蛋白的下调表达，并恢复了FTH、SLC7A11和GPX4的蛋白表达，抑制了Cox2的表达。这表明，抑制铁死亡可以有效缓解由瘤胃微生物紊乱引发的乳腺炎和血乳屏障损伤。

LPS剂量依赖性地激活铁死亡诱导小鼠乳腺上皮细胞炎症

瘤胃微生物紊乱如何远程调控乳腺？LPS是关键信使。体外实验表明，LPS能够剂量依赖性地降低小鼠乳腺上皮细胞（MMECs）的活力，促进炎症因子TNF-α和IL-1β的释放，增加细胞内活性氧（ROS）水平，耗竭GSH，升高MDA含量，并下调紧密连接蛋白和铁死亡抑制蛋白（FTH、SLC7A11、GPX4）的表达，同时上调Cox2的表达。这表明LPS是触发乳腺上皮细胞氧化应激和铁死亡的重要因子。

Fer-1通过抑制铁死亡缓解LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症

最后，研究人员在细胞水平验证了Fer-1的保护作用。预先用Fer-1处理MMECs，可以显著逆转LPS引起的细胞死亡、炎症因子释放、ROS爆发、GSH耗竭、MDA升高以及紧密连接蛋白和铁死亡相关蛋白的异常表达。这进一步证实了LPS通过诱导铁死亡导致乳腺上皮细胞损伤，而Fer-1通过抑制这一过程发挥保护作用。

本研究首次系统地阐明了“高精料饮食→瘤胃微生物紊乱→LPS升高→氧化应激→铁蛋白自噬-铁死亡→乳腺炎”这一完整的病理轴。研究不仅揭示了瘤胃微生物紊乱通过LPS激活铁死亡的新机制，为理解“瘤胃-乳腺轴”提供了重要的分子基础，而且通过铁死亡抑制剂Fer-1的有效干预，为防治由营养代谢失衡引起的乳腺炎提供了新的潜在靶点。尽管研究存在一些局限性，例如瘤胃微生物移植不能完全模拟反刍动物瘤内的复杂微环境，抗生素预处理本身可能影响免疫状态等，但这项工作的创新性和重要性不言而喻。它深化了人们对营养、微生物与宿主健康之间复杂关系的认识，为开发针对奶牛和奶山羊乳腺炎的新防治策略奠定了坚实的理论基础。