促红细胞生成素（Erythropoietin）能够促进 Neuro-2A 小鼠神经母细胞瘤细胞的增殖

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Erythropoietin promotes cell proliferation in Neuro-2A mouse neuroblastoma cells

　　Epo稳定表达促进N2A神经元增殖且不依赖EpoR，为研究替代受体提供新模型。

　　### 人类EPO在神经细胞中的表达与功能研究

#### 引言

Erythropoietin（Epo）是一种重要的糖蛋白激素，主要由成年人的肾脏产生，其核心功能是调控红细胞的生成。通过与Epo受体（EpoR）结合，Epo能够激活一系列信号通路，从而促进红细胞的增殖、分化和存活。然而，近年来的研究表明，Epo不仅在红细胞生成中发挥关键作用，还在多种组织的保护中具有潜在价值，例如神经系统、心血管系统和肾脏。这种广泛的生物学作用引发了科学家对Epo非典型受体的关注，因为其作用机制可能与传统的EpoR不同。

尽管已有研究发现EpoR在非造血组织（如神经元、星形胶质细胞和内皮细胞）中存在，但其在组织保护中的具体作用仍存在争议。一些实验表明，即使在缺乏EpoR的情况下，Epo仍能发挥神经保护作用。例如，在创伤性脑损伤模型中，神经元EpoR基因敲除小鼠仍然表现出显著的神经保护效应。这一现象暗示Epo可能通过其他受体或机制发挥作用。因此，识别Epo的替代受体成为理解其组织保护功能的关键。

为了进一步探讨Epo在神经细胞中的作用，本研究选择了两种常用的神经细胞模型：小鼠神经母细胞瘤细胞系N2A和小鼠海马神经元细胞系HT22。通过稳定表达人类EPO基因，我们观察了Epo对这两种细胞增殖的影响，并进一步探讨了其作用是否依赖于EpoR。

#### 材料与方法

##### 化学试剂

本研究中使用的所有化学试剂均为分析级，并购自多个知名供应商。例如，M-PER蛋白提取缓冲液和蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物由Fisher Scientific提供。用于ELISA的抗Epo抗体购自Stem Cell Technologies（加拿大）和Sigma-Millipore（美国），而用于Western blot分析的抗Epo抗体则来自R&D Systems（美国）。针对细胞增殖标志物的抗体，如核仁磷酸蛋白（NPM1）和增殖细胞核抗原（PCNA），则由Cell Signaling Technologies（美国）提供。此外，HRP标记的抗兔和抗鼠IgG抗体由Jackson ImmunoResearch（美国）提供，EpoR ELISA试剂盒由Biomatik（美国）提供。

##### 人类EPO基因的稳定表达

为了研究Epo在神经细胞中的作用，我们构建了一个包含人类EPO基因的基因表达载体，并将其导入N2A和HT22细胞中。首先，我们将合成的人类EPO基因与pCMV-Script表达载体进行限制性酶切，随后通过凝胶纯化、连接和转化等步骤，构建了稳定的基因表达系统。经过筛选和验证，我们获得了多个稳定的EPO表达克隆，并进一步进行了功能分析。

##### ELISA检测Epo表达水平

为了定量分析Epo的分泌情况，我们使用了经典的夹心ELISA方法。实验过程中，将ELISA板用抗Epo单克隆抗体包被，并在4°C下孵育过夜。随后，使用含有牛血清白蛋白（BSA）和吐温-20的封闭缓冲液进行封闭处理。接着，将不同浓度的培养基样品加入ELISA板中，并在4°C下孵育过夜。最后，加入HRP标记的二抗，经过洗涤后，使用邻苯二胺底物进行显色反应，并在405 nm波长下测定吸光度。通过构建标准曲线，我们能够准确计算出培养基中Epo的浓度。

##### Western blot分析细胞增殖标志物

为了进一步确认Epo对细胞增殖的影响，我们进行了Western blot分析。提取N2A和HT22细胞中的总蛋白，并通过12.5%的SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。随后，将蛋白转移到PVDF膜上，并使用抗Epo、抗PCNA和抗NPM1抗体进行检测。β-actin作为内参蛋白，用于确保蛋白加载的一致性。通过化学发光底物显影和图像分析系统，我们能够定量评估这些标志物的表达水平。

##### 细胞增殖速率的测定

为了研究Epo对细胞增殖的影响，我们选取了三个N2A克隆（C8、C10和C16）以及N2A仅载体对照组，分别接种于75 cm2的细胞培养瓶中。在培养过程中，每隔一定时间（24、48、72和96小时）使用Trypan蓝染色法测定细胞数量和活性。结果显示，Epo过表达的N2A细胞在24小时后即表现出显著的增殖优势，且在后续时间点继续保持更高的细胞数量。

对于HT22细胞，我们仅在48小时后进行了增殖分析。结果显示，HT22细胞的增殖速率并未受到Epo表达的影响，这表明Epo对N2A细胞的促增殖作用可能具有特异性。

##### BrdU细胞增殖实验

为了进一步验证Epo对N2A细胞增殖的刺激作用，我们进行了BrdU细胞增殖实验。BrdU是一种胸苷类似物，在细胞周期的S期被整合到新合成的DNA中。通过加入BrdU试剂，并在37°C下孵育2小时，我们能够检测到BrdU的整合情况。随后，使用BrdU检测抗体和HRP标记的二抗进行显色反应，并在450 nm波长下测定吸光度。结果显示，Epo过表达的N2A细胞在BrdU整合量上显著高于对照组，进一步支持了Epo对细胞增殖的促进作用。

##### CRISPR-Cas9介导的EPO和EPOR基因敲低

为了确定Epo促增殖作用是否依赖于EpoR，我们使用CRISPR-Cas9系统对N2A细胞中的EPO和EPOR基因进行了敲低实验。通过将靶向EPO和EPOR的CRISPR质粒导入N2A细胞，并使用对照质粒作为阴性对照，我们检测了敲低效率。结果显示，敲低EPO基因能够显著降低Epo的分泌水平，并抑制细胞增殖，而敲低EPOR基因则对细胞增殖无明显影响。这一结果表明，Epo在N2A细胞中的促增殖作用可能与EpoR无关，而是通过其他未知的受体实现的。

##### 统计分析

所有实验数据均使用GraphPad Prism软件进行统计分析，结果以均值±标准误（SEM）的形式表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Brown-Forsythe和Bartlett检验。p值≤0.05被认为具有统计学意义。

#### 结果

##### EPO在N2A和HT22细胞中的表达

通过ELISA检测，我们发现N2A细胞在EPO过表达后，培养基中Epo的浓度显著增加，最高可达24 ng/mL。相比之下，HT22细胞的Epo表达水平较低，且在培养基中未观察到显著的Epo分泌。此外，Western blot分析进一步证实了Epo在N2A细胞中的表达，并且表现出不同的糖基化形式，这可能与其促增殖作用有关。

##### Epo对N2A细胞增殖的影响

在N2A细胞中，Epo过表达显著促进了细胞增殖。通过细胞计数实验，我们发现C8、C10和C16三个克隆在24小时后细胞数量均高于对照组。在后续时间点（48、72和96小时），这种增殖优势持续存在，其中C8克隆的增殖速率最高。值得注意的是，细胞活性在所有组别中保持一致，表明Epo对细胞增殖的刺激作用并不伴随细胞死亡的增加。

##### Epo对HT22细胞增殖无影响

相比之下，HT22细胞在EPO过表达后并未表现出显著的增殖刺激。这可能与HT22细胞的特性有关，也可能表明Epo对神经细胞的促增殖作用具有细胞类型特异性。通过BrdU实验和Western blot分析，我们发现HT22细胞的细胞周期相关蛋白（如PCNA和NPM1）表达水平与对照组相似，进一步支持了这一结论。

##### Epo促增殖作用不依赖于EpoR

为了验证Epo促增殖作用是否依赖于EpoR，我们进行了CRISPR-Cas9介导的EPOR基因敲低实验。结果显示，尽管EPOR表达水平下降了44%，但N2A细胞的增殖速率并未受到影响。这表明，Epo在N2A细胞中的促增殖作用可能通过其他受体实现，而非传统的EpoR。这一发现为探索Epo的替代受体提供了新的方向。

#### 讨论

##### Epo在神经细胞中的表达与功能

尽管Epo的主要功能是促进红细胞生成，但其在神经细胞中的作用也逐渐受到关注。研究发现，Epo不仅在神经元中表达，还在星形胶质细胞和小胶质细胞中存在。这种内源性表达可能与神经保护和神经再生有关。然而，Epo在神经细胞中的作用机制尚不明确，尤其是在非造血组织中的信号传导途径。

##### Epo对细胞增殖的刺激作用

本研究首次在神经细胞模型中实现了Epo的稳定表达，并观察到其对N2A细胞增殖的显著促进作用。这一发现表明，Epo可能在某些神经细胞中具有促进增殖的功能。然而，这一效应在HT22细胞中并未观察到，提示Epo对不同神经细胞的促增殖作用可能存在差异。

##### EpoR在N2A细胞中的作用

尽管EpoR在多种细胞类型中均存在，但本研究显示，其在N2A细胞中的促增殖作用并不显著。这一结果与之前在癌症细胞中观察到的EpoR依赖性增殖作用形成对比，提示Epo可能通过不同的机制在不同细胞类型中发挥作用。例如，在卵巢癌细胞中，EphB4被报道为可能的替代受体，但在N2A细胞中并未检测到EphB4的表达。

##### 临床意义与潜在风险

尽管Epo在治疗贫血等疾病中具有重要价值，但其在促进肿瘤生长中的潜在作用也不容忽视。一些临床试验表明，Epo可能在某些癌症患者中导致不良预后，如增加肿瘤进展和降低总体生存率。这一现象提示，Epo的促增殖作用可能具有双重性，既可能有益于某些细胞类型，也可能对肿瘤细胞产生促进作用。

##### 未来研究方向

本研究的结果为探索Epo的替代受体提供了新的模型。N2A细胞能够稳定表达Epo，并表现出显著的增殖刺激，这使其成为研究Epo组织保护功能的理想工具。通过结合化学交联剂、共免疫沉淀和质谱分析等技术，我们有望识别出Epo的替代受体，并进一步验证其在不同细胞类型中的作用机制。此外，还需在其他癌细胞系中开展类似研究，以确定EpoR是否在肿瘤细胞增殖中起关键作用，或是否存在其他替代受体。

#### 结论

本研究首次在神经细胞模型中观察到Epo的促增殖作用，并发现其可能不依赖于传统的EpoR。这一结果不仅拓展了我们对Epo生物学功能的理解，也为探索其组织保护机制提供了新的思路。尽管Epo的替代受体尚未明确，但N2A细胞模型的建立为未来的研究提供了宝贵的资源。通过进一步研究，我们有望揭示Epo在不同细胞类型中的作用机制，并评估其在临床应用中的潜在风险。

#### 数据与材料的可用性

本研究的所有数据均通过合理的请求可以从通讯作者处获得。这些数据将为后续研究提供支持，并有助于进一步验证Epo在神经细胞中的作用机制。

#### 资金支持

本研究得到了美国国家通用医学科学研究所（NIGMS）的资助，资助编号为1GM11178，由J.H. Xie博士负责。此外，Finn Hynes的研究也得到了美国国家心理健康研究所（NIMH）的资助，项目编号为MH129791，由Alex Marshall、Wendy Grillo和Gregory Cole博士共同支持。这些资金为本研究的顺利进行提供了重要保障。