《Chemico-Biological Interactions》：Investigating the neurodevelopmental toxicity of graphene oxides using 3D human brain organoids and zebrafish models: emphasis on GABAergic neuron alterations at single-cell resolution
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石墨烯氧化物（GOs）通过影响GABA能神经元突触功能及神经退行相关通路（ko05022）和内质网蛋白处理（ko04141），表现出神经发育毒性，结合3D脑器官单细胞测序与斑马鱼模型验证了其机制。
陈宇娜|赵伟超|甘璐|黄超博|刘旭东|龙定新|曹毅
中国南方医科大学衡阳医学院公共卫生学院，湖南省典型环境污染与健康危害重点实验室，衡阳421001，中国
摘要
暴露于氧化石墨烯（GOs）可能会引发神经毒性效应，但这些效应的机制和程度仍不明确，部分原因是传统神经毒性模型的局限性。在本研究中，我们利用3D人脑类器官和斑马鱼幼体来探究GOs引起的神经发育毒性。在3D人脑类器官中，GOs以剂量依赖的方式显著降低了细胞存活率，而批量RNA测序显示对神经元相关通路的影响很小。然而，单细胞RNA测序揭示了谷氨酸能和GABA能神经元中的显著变化，尤其是在与突触功能和神经元发育相关的基因本体术语上。进一步分析表明，GOs暴露影响了GABA能神经元的定位、形态和电生理活性。此外，参与神经退行性病变（ko05022）和内质网蛋白处理（ko04141）的关键基因在GABA能神经元中发生了失调。体内研究使用斑马鱼幼体显示运动行为改变，包括在黑暗周期中过度活跃以及在光照周期中游泳距离减少，同时特定脑区的GABA能神经元数量减少。这些发现突显了GOs的潜在神经发育毒性，尤其是通过其对GABA能神经元的影响，并强调了结合3D人脑类器官和斑马鱼模型以及单细胞分辨率技术的价值，以更好地理解纳米材料的神经毒性效应。
引言
氧化石墨烯（GOs）是最早发现的二维纳米材料（NMs），在日常生活[1]和研究中[3][4]得到广泛应用，这引发了公众对其潜在毒性的担忧。其中，GOs对中枢神经系统（CNS）的神经毒性引起了广泛关注。这是因为GOs具有相对较小的横向尺寸，使其能够在环境暴露后穿过血脑屏障并在CNS中积累[5][6]。此外，由于其在神经生物学中的潜在应用，基于GO的NMs可能在医疗治疗过程中直接与神经系统相互作用[7][8]。尽管对该领域的兴趣日益增长，但GOs的确切神经毒性效应仍存在争议。一方面，有研究表明基于GO的NMs具有高生物相容性，可用于神经科学研究[9][10]，两项研究报道了GOs对小鼠模型中帕金森病的有益效果[11][12]。然而，也有报道指出GOs在许多模式生物中引发了神经毒性，如小鼠[13][14]、斑马鱼[15][16]和秀丽隐杆线虫[17]。因此，基于GO的材料对模式动物的神经毒性仍需进一步研究。
人类和动物CNS结构之间的差异进一步增加了将动物数据外推到人类的复杂性。虽然之前的研究使用人类细胞系来评估GOs的神经毒性[18][19][20][21]，但传统的二维细胞培养与人类大脑的复杂结构相比过于简化。近年来，3D人脑类器官作为一种有前景的替代方案出现，比传统的二维模型更准确地模拟了人类大脑[22][23]。这些类器官已被用于研究各种NMs的神经毒性，包括银纳米颗粒（NPs；Huang等人，2022年）、ZnO NPs[25]和多壁碳纳米管[26]。此外，一些研究将3D脑类器官与动物模型结合，以研究内分泌干扰化学物质[27]、苯甲酮[28]和香叶醇[29]的神经发育毒性。通过这种方式，可以部分解决上述动物模型和传统二维细胞培养的局限性。然而，仍需要更多研究将这两种模型结合起来，以研究NMs的神经毒性。
在本研究中，我们将3D人脑类器官与斑马鱼幼体结合，以探究GOs的神经发育毒性。最初，我们分析了之前工作[30]中的批量RNA测序数据，但由于模型的细胞异质性，这些数据未能完全捕捉到GOs对类器官中神经元的影响[22]。为了克服这一限制，我们采用了单细胞RNA测序和荧光显微断层扫描（MOST）技术来探讨GOs对主要神经元群体的影响。随后，我们使用斑马鱼幼体（一种公认的用于研究神经发育毒性的模型[31][32]）验证了我们的发现。通过结合这两种模型，我们旨在提供关于GOs在人类中潜在神经毒性效应的更可靠见解。
章节片段
3D人脑类器官
我们从中国科学院干细胞银行购买了人类诱导多能干细胞（iPSCs）DYR0100。为了构建3D人脑类器官，首先将这些iPSCs分化为神经前体细胞，然后按照之前描述的分化方法[33]逐步给予视黄酸，以分化为不同的神经元群体。该模型由Hopstem Bioengineering（中国杭州）进行了90天的分化。
GOs对3D人脑类器官的体外毒性
如图1所示，所有测试浓度都以剂量依赖的方式显著降低了细胞存活率。浓度为12.5 μg/mL（p<0.05）或50 μg/mL（p<0.01）的GOs显著降低了细胞存活率。
GOs对体外神经元的影响
批量RNA测序数据分析显示，共有10个基因本体术语和2个KEGG通路与突触功能相关，但没有一个在GO暴露后发生统计学上的显著变化（p>0.05）。只有突触
讨论
在本研究中，我们结合了3D人脑类器官和斑马鱼幼体来探究GOs的神经发育毒性，因为这些模型在体外和体内评估神经毒性方面具有互补的优势[22][32]。结果表明，在细胞毒性浓度下，GOs显著影响了3D人脑类器官中谷氨酸能和GABA能神经元的通路。然而，这些效应仅通过单细胞RNA测序检测到，而
CRediT作者贡献声明
赵伟超：撰写——审稿与编辑、数据分析。陈宇娜：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析、概念化。黄超博：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。甘璐：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。龙定新：撰写——审稿与编辑、监督、数据分析、概念化。刘旭东：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。曹毅：
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（82373619）的财政支持。
