CysLTR1抑制剂对5xFAD阿尔茨海默病小鼠视网膜神经血管单元细胞的影响

《Evolving Earth》：The effect of CysLTR1 inhibition on cells of the retinal neurovascular unit in 5xFAD Alzheimer mice

　　阿尔茨海默病视网膜神经血管单元中蒙脱拉唑抑制CysLTR1对周细胞覆盖率、毛细血管直径及胶质细胞的影响研究。

　　### 研究背景与意义

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种常见的痴呆类型，属于多因素引起的神经退行性疾病，不仅影响大脑，还涉及视网膜的病变。近年来，越来越多的研究表明，AD的多种病理特征，如神经炎症和血管变化，也表现在视网膜中。视网膜作为中枢神经系统（CNS）的一部分，与大脑在结构和功能上具有高度相似性，因此，它被视作研究AD病理变化的潜在窗口。在AD的进展过程中，神经血管单元（neurovascular unit，NVU）的破坏和功能障碍被认为是关键因素之一。NVU由神经元、胶质细胞（包括星形胶质细胞和小胶质细胞）以及血管细胞（如周细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞）组成，它在调节血流、维持神经元代谢活性以及保持血脑屏障（BBB）和视网膜血屏障（BRB）的完整性方面发挥着重要作用。因此，研究NVU在AD中的变化，有助于理解疾病的发生机制，并为开发新的治疗策略提供依据。

本研究旨在探讨CysLTR1受体拮抗剂蒙特鲁卡斯（montelukast，MTK）对5xFAD小鼠模型中视网膜NVU细胞的影响。5xFAD是一种常用于AD研究的转基因小鼠模型，其表现出快速的病理特征，包括淀粉样蛋白沉积和认知功能障碍。通过分析MTK对视网膜微血管结构和功能的影响，我们希望揭示其在AD相关神经血管变化中的潜在作用。本研究的发现不仅有助于理解AD的病理机制，也为探索治疗AD的新靶点提供了重要线索。

### 研究方法与材料

本研究使用了44只5xFAD转基因小鼠，这些小鼠在实验开始时为5个月龄，接受为期13周的MTK或对照药物（vehicle）的口服治疗。治疗结束后，小鼠被处死，通过心脏灌注获取眼球，并在室温下固定于4%缓冲福尔马林溶液中。随后，眼球被处理成组织切片，并用于免疫荧光（IF）分析。为了评估MTK对视网膜NVU的影响，我们重点分析了以下指标：周细胞（pericytes，PCs）覆盖情况、毛细血管直径、小胶质细胞密度、星形胶质细胞反应性以及视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）密度。

在免疫荧光实验中，我们使用了多种抗体，包括针对NG2的抗体（用于标记周细胞和血管平滑肌细胞）、针对胶原蛋白IV（ColIV）的抗体（用于标记血管结构）、针对Iba1的抗体（用于标记小胶质细胞）、针对GFAP的抗体（用于标记星形胶质细胞）以及针对Brn3a的抗体（用于标记RGCs）。为了确保实验的准确性，所有实验均采用双盲方法进行，以避免主观偏见。此外，为了减少固定过程中可能引入的伪影，我们仅对形态学进行分析，而不进行功能测试。

在图像分析方面，我们使用了共聚焦激光扫描显微镜（LSM710，Zeiss）对视网膜进行高分辨率成像。随后，通过ImageJ软件对图像进行处理，包括血管结构的分割、血管分支的计数、血管连接点的识别以及PC覆盖的测量。我们特别关注了视网膜浅层毛细血管网络的微血管变化，包括PC覆盖、毛细血管直径以及小胶质细胞密度。为了确保结果的可靠性，每组实验至少重复三次，并采用双尾方差分析（Two-way ANOVA）和Dunnett多重比较检验，以确定统计学上的显著性差异。

### 研究结果

#### 1. MTK对周细胞覆盖的影响

在本研究中，我们发现MTK对5xFAD小鼠的视网膜NVU细胞具有一定的影响。具体而言，在浅层毛细血管网络中，MTK治疗显著增加了周细胞的覆盖密度，尤其是在中央和中间区域。然而，在外周区域，MTK对PC覆盖的影响并不明显。这一结果表明，MTK对周细胞的调节作用可能具有一定的空间特异性。值得注意的是，在未治疗的5xFAD小鼠中，外周区域的PC覆盖显著增加，而对照组（wt）小鼠的PC覆盖则相对较低。这可能意味着，在AD背景下，PC覆盖的变化可能受到多种因素的影响，而MTK可能通过某种机制促进了PC的增殖或迁移。

#### 2. MTK对毛细血管直径的影响

我们还发现，在5xFAD小鼠中，毛细血管直径在某些区域发生了显著的缩小。这种变化在未接受MTK治疗的5xFAD小鼠中尤为明显，而在接受MTK治疗的动物中，毛细血管直径并未显著改变。这一结果表明，MTK可能对毛细血管直径的调节作用有限，或者其影响主要局限于特定的区域。此外，值得注意的是，在其他研究中，MTK已被证明能够逆转衰老过程中毛细血管直径的减少，这提示我们可能需要进一步探讨MTK对毛细血管直径的影响是否与AD病理特征有关。

#### 3. MTK对小胶质细胞密度的影响

在分析小胶质细胞密度时，我们发现5xFAD小鼠的视网膜中，小胶质细胞的数量显著高于wt对照组。这一结果与多项研究一致，表明AD的进展与小胶质细胞的激活密切相关。然而，MTK的治疗并未显著改变小胶质细胞的密度。这可能意味着，MTK对小胶质细胞的调节作用主要体现在其他方面，如小胶质细胞表型的改变。此外，我们还注意到，在未接受MTK治疗的5xFAD小鼠中，小胶质细胞的分布存在一定的异质性，这可能与AD的不同病理阶段有关。

#### 4. MTK对星形胶质细胞反应性的影响

在星形胶质细胞的反应性方面，我们发现MTK的治疗并未显著改变GFAP阳性区域的面积。GFAP是星形胶质细胞的一个标志性蛋白，其表达水平通常用于评估星形胶质细胞的反应性。这一结果表明，MTK可能对星形胶质细胞的反应性没有直接的影响。然而，值得注意的是，在其他研究中，MTK已被证明能够减轻AD小鼠的神经炎症反应，这提示我们可能需要进一步探讨其对星形胶质细胞反应性的间接影响。

#### 5. MTK对RGC密度的影响

在视网膜神经节细胞（RGCs）的密度方面，我们发现MTK的治疗并未显著改变RGCs的数量。这一结果表明，MTK可能对RGCs的存活或功能没有直接的影响。然而，在AD的进展过程中，RGCs的密度变化可能与神经退行性变有关，因此，我们需要进一步研究MTK是否能够通过其他机制影响RGCs的健康状态。

### 讨论与分析

本研究的结果表明，MTK在5xFAD小鼠模型中对视网膜NVU细胞具有一定的调节作用，尤其是在周细胞覆盖方面。然而，MTK对毛细血管直径和小胶质细胞密度的影响并不显著。这提示我们，MTK可能对NVU的不同组成部分具有不同的作用机制。此外，我们发现，5xFAD小鼠的视网膜中存在一定的血管变化，如毛细血管直径的缩小，这可能与AD的病理特征有关。

在讨论这些结果时，我们需要注意，本研究的局限性之一是仅对形态学进行分析，而没有进行功能测试。这意味着，我们无法直接评估MTK对血流或屏障功能的影响。此外，我们仅分析了固定组织，因此无法对CysLTR1的表达水平进行定量分析。这些限制可能会影响我们对MTK作用机制的全面理解。

另一个需要注意的问题是，我们使用的WT小鼠并非与5xFAD小鼠为同窝兄妹，而是年龄匹配的C57Bl/6J小鼠。这种选择可能会影响我们对AD与正常小鼠之间差异的准确评估。此外，我们未能检测到视网膜中的Aβ沉积，这可能是由于所使用的抗体或检测方法的限制。

尽管存在这些局限性，本研究的结果仍然具有重要的意义。首先，我们发现MTK能够增加周细胞的覆盖，这可能对血管的稳定性具有积极影响。其次，我们发现5xFAD小鼠的视网膜中存在一定的血管变化，这可能为AD的早期诊断提供新的思路。最后，我们发现小胶质细胞的密度在AD小鼠中显著增加，这提示我们，小胶质细胞在AD的进展中可能发挥着重要作用。

### 未来研究方向

为了进一步探讨MTK对AD视网膜NVU的影响，我们需要进行更多的研究。首先，应使用功能测试方法，如血流测量和屏障功能评估，以更全面地了解MTK的作用机制。其次，应进行CysLTR1表达水平的定量分析，以评估其在AD病理中的潜在作用。此外，应使用年龄更长的5xFAD小鼠，以观察RGCs的密度变化是否与AD的进展有关。最后，应进一步研究MTK是否能够通过改变小胶质细胞的分布或表型来影响AD的病理特征。

### 结论

综上所述，本研究揭示了5xFAD小鼠模型中视网膜NVU细胞的一些变化，特别是周细胞覆盖的增加。然而，MTK对毛细血管直径和小胶质细胞密度的影响并不显著。这些结果提示我们，MTK可能对NVU的某些部分具有调节作用，但其对整个NVU的影响仍需进一步研究。未来的研究应关注MTK对血流和屏障功能的潜在影响，以及其对其他NVU组成部分的作用机制。此外，还需要探讨MTK是否能够通过改变小胶质细胞的分布或表型来影响AD的进展。