由Bacillus velezensis DB219及其突变体E361I所产生的牛奶凝固酶对牛酪蛋白进行水解时所表现出的特征性变化

《Food Bioscience》：The characteristic changes of bovine casein hydrolyzed by Bacillus velezensis DB219 and its mutant E361I milk-clotting enzyme

　　本研究系统评估了Bacillus velezensis DB219 MCE、其突变体E361I MCE及牛 rennet对牛乳清蛋白的水解、凝聚特性及奶酪感官品质的影响。实验表明E361I MCE在酶活性、凝胶弹性和感官特性上显著优于DB219 MCE，其MCA/PA比值达21，接近牛 rennet水平，且能增强乳清蛋白的疏水性和α螺旋含量，使奶酪弹性模量(G′)提升37.2%。感官测试显示E361I MCE制备的奶酪在风味、质地等6个维度评分均高于对照。

　　在乳制品工业中，牛奶凝乳酶（Milk Clotting Enzyme, MCE）扮演着至关重要的角色。MCE通过催化乳蛋白的水解，促使牛奶形成凝乳，从而影响奶酪的产量、质地和风味。目前，传统的奶酪生产主要依赖于小牛胃提取物，但其使用受到原料供应限制、伦理问题以及对环境影响等因素的制约。因此，寻找具有类似功能的MCE替代品成为当前研究的热点。本研究聚焦于一种从土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌（*Bacillus velezensis*）DB219所提取的MCE及其突变体E361I MCE，与小牛胃提取物进行比较，分析其对牛乳酪蛋白的水解、聚集及流变特性的影响，并进一步评估由此制成的奶酪的感官特性。

牛乳酪蛋白是乳蛋白的主要组成部分，约占乳蛋白总量的80%。它主要由αs1-酪蛋白（αs1-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）和αs2-酪蛋白（αs2-CN）组成。这些酪蛋白在乳中自组装成微胶粒结构，其稳定性主要依赖于胶体钙磷酸盐（Colloidal Calcium Phosphate, CCP）。其中，κ-酪蛋白在微胶粒的稳定中起着关键作用，其N端锚定在微胶粒表面，而C端则延伸至水相，通过静电和空间位阻效应维持微胶粒的分散状态。MCE的作用是水解κ-酪蛋白，释放出具有亲水性的大肽，同时保留部分肽段在微胶粒内部，最终促使微胶粒形成三维网络结构，实现凝乳。钙离子（Ca2?）在此过程中起到桥梁作用，通过中和电荷、连接相邻微胶粒，从而促进微胶粒的聚集和凝乳的形成。

MCE的特性对其在奶酪生产中的应用至关重要。理想情况下，MCE应具备较高的牛奶凝乳活性（Milk Clotting Activity, MCA）与蛋白酶活性（Proteolytic Activity, PA）的比值（MCA/PA），因为这一比值直接决定了MCE对酪蛋白的水解效率以及奶酪的感官和物理性质。高MCA/PA比值的MCE能够更有效地促进凝乳形成，同时减少对乳蛋白的过度水解，从而降低奶酪的苦味并提高其整体质量。相比之下，许多植物来源和细菌来源的MCE由于其较低的MCA/PA比值和较高的蛋白酶活性，往往导致奶酪产量较低、风味较差，甚至在某些情况下限制了其实际应用。

本研究中，实验室分离并纯化的* Bacillus velezensis * DB219 MCE及其突变体E361I MCE被选为研究对象。通过基因定点突变和诱导表达筛选，E361I MCE在MCA/PA比值方面表现出显著优势。相较于DB219 MCE的MCA/PA比值为9.2，E361I MCE的该比值达到了21。这一提升表明，E361I MCE在水解酪蛋白的同时，对乳蛋白的过度降解作用有所抑制，从而可能改善奶酪的感官特性。

在对酪蛋白水解过程的分析中，研究发现E361I MCE在水解效率上优于DB219 MCE，其水解程度达到了5.9%，接近小牛胃提取物的水平。这一结果意味着E361I MCE能够更有效地分解酪蛋白，进而促进凝乳的形成。同时，E361I MCE表现出更高的浊度（OD600），表明其在水解过程中能够更迅速地引发酪蛋白的聚集。浊度的变化曲线显示，随着水解时间的延长（30-55分钟），酪蛋白的浊度先升高后降低，这表明在某一临界点之后，酪蛋白的聚集达到饱和，导致浊度下降。这一现象为理解MCE在酪蛋白水解过程中的作用机制提供了重要线索。

此外，E361I MCE在泡沫形成能力（Foaming Capacity, FC）和泡沫稳定性（Foam Stability, FS）方面也优于DB219 MCE。其泡沫形成能力达到了75.60%，而泡沫稳定性为28.36%。这一特性对于奶酪的质地和口感具有重要意义，因为较高的泡沫形成能力通常与更好的乳蛋白结构变化有关，而泡沫稳定性则反映了乳蛋白在形成凝乳过程中保持结构的能力。相比之下，DB219 MCE的泡沫形成能力和泡沫稳定性较低，这可能与其对酪蛋白的水解模式不同有关。

在乳蛋白聚集特性方面，E361I MCE表现出更快的ζ电位中和、更大的平均粒径（671.83 ± 2.94 nm）、更高的总半胱氨酸（-SH）含量（23.53 μmol/g）、更强的内在荧光强度以及更高的表面疏水性。这些特性共同表明，E361I MCE能够更有效地促进酪蛋白的聚集过程，从而改善凝乳的结构和奶酪的质地。ζ电位的中和是乳蛋白聚集的关键步骤之一，因为当电位下降至零时，微胶粒之间的静电排斥力消失，从而更容易发生聚集。更大的平均粒径和更高的表面疏水性则进一步增强了微胶粒之间的相互作用，使凝乳更加紧密。

通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）分析，研究发现E361I MCE能够引起更显著的酪蛋白结构变化。这表明，E361I MCE在水解过程中不仅改变了酪蛋白的化学结构，还影响了其物理结构，从而对凝乳的形成和奶酪的质地产生更深远的影响。同时，利用远紫外圆二色光谱（Far-UV Circular Dichroism, CD）和傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）测量，研究发现E361I MCE能够显著增加酪蛋白中的α-螺旋含量。α-螺旋是蛋白质结构中的一种重要构象，其含量的变化可能影响蛋白质的聚集行为和凝乳的物理特性。

在流变特性方面，研究通过大振幅振荡剪切（Large Amplitude Oscillatory Shear, LAOS）分析发现，E361I MCE处理后的牛乳凝胶表现出更高的弹性模量（G′）和粘性模量（G″）。这表明，E361I MCE能够更有效地改变酪蛋白的构象，使其形成更加紧密和稳定的凝胶结构。这种结构的变化不仅影响奶酪的物理性质，如硬度和弹性，还可能对奶酪的口感和外观产生积极影响。

从感官评价的角度来看，E361I MCE处理后的奶酪在风味、口感、组织结构、外观和整体接受度方面均优于DB219 MCE处理的奶酪。这表明，E361I MCE不仅在理化特性上表现出色，而且在实际应用中能够提供更优质的奶酪产品。相比之下，DB219 MCE处理的奶酪在某些感官属性上表现较差，可能与其较低的MCA/PA比值和较差的酪蛋白聚集能力有关。

综上所述，E361I MCE在多个方面均表现出优于DB219 MCE的特性，包括水解效率、聚集能力、泡沫形成能力、流变特性以及最终的奶酪感官品质。这些结果表明，E361I MCE具有作为小牛胃提取物替代品的潜力，能够有效提升奶酪的产量和质量。此外，该研究为深入探讨MCE在乳蛋白水解过程中的作用机制提供了重要的实验依据，同时也为评估MCE在实际奶酪生产中的应用前景提供了科学参考。通过微观层面的分析和实际应用的验证，E361I MCE不仅展示了其在乳制品加工中的价值，还为开发新型生物催化剂提供了方向。