关于射频和热诱导灭活黑曲霉孢子的效果及其机制的多维度比较研究

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Multidimensional comparative study on the efficacy and mechanisms of radiofrequency and thermal induction inactivation of Aspergillus Niger spore

　　本研究对比射频（RF）与常规加热对黑曲霉孢子的灭活效果，发现RF在80℃/3分钟时灭活效率更高（4.36 vs 3.78 log CFU/mL）。RF通过膜破坏和代谢崩溃快速灭活，其非热效应在60℃下显著，蛋白质组学分析揭示RF特异性干扰代谢途径，为食品灭菌提供高效节能方案。

　　

刘玉迪|童彦军|黄涵|赵伟|杨瑞金

江南大学食品科学与资源国家重点实验室，中国江苏省无锡市214122

摘要

射频（RF）处理为传统的热灭活方法提供了一种有前景的替代方案，然而其对抗真菌的机制仍不甚明了。本研究探讨了在60–80°C条件下，射频与传统加热方式对黑曲霉孢子的灭活动力学、形态变化及蛋白质组响应的差异。结果表明，在磷酸盐缓冲液中，射频处理在80°C/3分钟时能够实现更高的灭活率（减少了4.36 log CFU/mL），而传统加热方法仅减少了3.78 log CFU/mL（p < 0.05）。两种处理方法均导致孢子收缩、膜通透性增加、活性氧（ROS）水平升高以及线粒体去极化；然而，通过透射电子显微镜（TEM）观察发现，射频处理引起的结构破坏更为严重。无标记蛋白质组学分析鉴定了1346个差异表达的蛋白质，GO和KEGG分析显示射频处理早期抑制了代谢途径，并针对特定分子靶点发挥作用，这强调了其在较低温度（60°C）下的非热效应。这些发现揭示了射频的独特作用机制——通过破坏膜结构和干扰代谢过程实现快速杀灭效果，表明其是一种高效、节能的食品安全和灭菌方法。

引言

近年来，全球经济的快速发展导致对粉状食品的需求大幅增加，同时也引发了对其微生物安全性的担忧（Akarca等人，2019；Liu等人，2017）。尽管细菌和病毒污染一直是食品安全评估的主要关注点，但真菌病原体（尤其是丝状真菌）所带来的风险却被严重低估（Bouakline等人，2000；Nordin等人，2022；Schaarschmidt等人，2016）。霉菌具有极强的耐干燥能力，能够在食品生产的多个阶段存活，包括培养、收获、干燥和储存过程，尤其是在卫生条件不佳的情况下（Frentzel等人，2018；Schweiggert等人，2007）。这种耐受性使得某些真菌能够合成霉菌毒素，这些毒素与不良健康效应有关，如过敏性肺泡炎、哮喘和皮肤感染（Barnes，2019；McDonnell & Aronica，2022）。尤其值得关注的是，未充分消毒的粉状食品进入消费市场，可能直接或间接危害健康。

黑曲霉是谷物、坚果和水果中的主要腐败菌，在全球供应链中的检出率超过30–80%（Xue等人，2025）。这种喜干真菌具有显著的热耐受性，其孢子在60°C下可存活超过60分钟（Zhang等人，2025），使得传统的灭菌方法对于低水分食品无效。

目前常用的消毒方法包括热处理、微波处理、化学熏蒸和伽马辐照（Kang等人，2019）。然而，热处理和微波处理会损害食品的感官和营养价值，并且无法实现完全灭活（Dag等人，2022；Kutlu等人，2022）。由于环境持久性和健康风险，化学熏蒸剂和伽马辐照的应用受到越来越多的限制（Duncan等人，2017；Moosavi等人，2021）。因此，需要开发成本效益高、节能且安全的替代灭菌技术。

射频（RF）加热作为一种有前景的介电处理方式，利用3–300 MHz的电磁波实现快速、均匀的体积加热，优于对流加热方法（Ling等人，2020；Zhang等人，2022；Zhang等人，2021）。研究表明，射频在低水分食品中能够有效灭活孢子，使黑曲霉孢子的数量减少2–6 log对数级，同时保留超过90%的营养成分（Bermudez-Aguirre & Niemira，2023；Zhang等人，2022）。然而，射频抗真菌效果的机制基础——尤其是由电场诱导的蛋白质变化所介导的非热效应——仍需进一步研究（Liu等人，2023）。

值得注意的是，射频的抗菌作用可能超出单纯的热灭活范围（Wust等人，2020；Zhou等人，2023）。有研究表明，射频处理过程中产生的电场可能引发非热效应，从而在亚致死温度下导致微生物死亡（Dieper等人，2024；Zhou等人，2024）。高温应力会导致蛋白质变性并丧失功能，引发微生物细胞的应激反应（Cui等人，2022）。因此，射频处理可能对细胞蛋白质产生与传统热处理不同的影响。然而，这一机制尚未得到全面研究。

在本研究中，使用黑曲霉作为模型真菌，比较了射频处理与传统热处理的灭活动力学和灭菌效率。通过ATP定量、流式细胞术、形态分析和蛋白质组学分析，探讨了孢子灭活的机制，重点关注射频处理的潜在非热效应。这些发现有助于深入理解射频在粉状食品中的杀菌机制，并为开发更安全、更有效的微生物控制技术提供支持。

部分内容摘录

真菌菌株及培养条件

用于体外研究的黑曲霉菌株由江南大学食品科学与技术学院提供，从多香果中分离获得。通过PCR扩增ITS区域（使用ITS1/ITS4引物）进行分子鉴定，随后通过BLAST分析和系统发育树构建确认物种（见图S1）。

黑曲霉菌株在28°C、相对湿度80%的条件下，培养于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。

射频和热处理对黑曲霉孢子的灭活动力学和效率

图1展示了黑曲霉孢子在热处理和射频处理下的灭活实验数据。正如Palaniappan等人（1990）所指出的，区分热效应和非热（电磁场）效应具有挑战性。因此，为了进行有意义的比较，对照样本必须经历与射频处理样本相同的热处理过程（见表1）。

为了阐明黑曲霉孢子在热处理和射频处理下的灭活动力学……

结论

总之，本研究表明，射频处理在灭活黑曲霉孢子方面优于传统加热方法，在80°C下3分钟后，射频处理的灭活率更高（4.36 log vs 3.78 log；p < 0.05）。虽然两种方法都引发了线粒体凋亡，但射频处理导致了更广泛的细胞损伤，包括细胞皮层解体和裂解。蛋白质组学分析显示，射频处理特异性地干扰了代谢途径，而高温处理则引发了更广泛但程度较低的细胞损伤。

作者贡献声明

刘玉迪：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，方法学设计，实验研究。童彦军：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计，实验研究。黄涵：方法学设计，实验研究。赵伟：实验研究。杨瑞金：资源获取，项目管理，资金筹措。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFD2100401）的资助。