细胞衰老相关基因标签预测皮肤黑色素瘤预后及免疫特征的创新研究

《Hormones & Cancer》：Cellular senescence related gene signature predicts prognosis and immune features in skin cutaneous melanoma

　　本研究针对皮肤黑色素瘤(SKCM)预后评估和免疫治疗响应预测的临床难题，通过分析TCGA数据库构建了包含12个基因的细胞衰老相关特征(CSRS)。研究发现CSRS能有效区分患者风险等级，揭示高水平细胞衰老可能通过衰老相关分泌表型(SASP)增强免疫监视作用。实验验证表明RUVBL2基因促进SKCM细胞增殖，为个体化治疗提供了新靶点。

　　

皮肤黑色素瘤(SKCM)作为最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤，其全球发病率持续攀升。据2020年统计数据显示，每年约有32.5万新发病例，导致约5.7万人死亡。更令人担忧的是，若当前趋势持续，预计到2040年每年新发病例将达51万例，死亡病例达9.6万例。尽管美国癌症联合委员会(AJCC)分期系统为SKCM提供了分类框架，但具有相似临床和病理特征的患者仍存在显著的预后差异。

近年来，免疫检查点抑制剂(ICIs)如PD-1/PD-L1和CTLA-4阻断剂在转移性黑色素瘤治疗中取得了重大突破，纳武利尤单抗(nivolumab)和伊匹木单抗(ipilimumab)的联合疗法使约50%的转移性黑色素瘤患者实现五年生存。然而，相对较低的反应率和频繁产生的耐药性限制了其广泛应用。因此，开发能够准确评估肿瘤微环境(TME)免疫状态并预测免疫治疗反应的工具有着迫切需求。

细胞衰老作为一种应对应激或损伤的不可逆生长停滞状态，在癌症生物学中扮演着复杂角色。虽然瞬时衰老是一种有效的肿瘤抑制机制，但衰老细胞的积累可能促进肿瘤发生。这种双重性主要归因于衰老相关分泌表型(SASP)——衰老细胞分泌的包括炎症细胞因子、趋化因子、基质重塑酶和生长因子在内的多种因子。在具有高突变负荷和复杂免疫相互作用的黑色素瘤中，细胞衰老在塑造肿瘤进展和治疗反应中的作用尚未得到充分探索。

本研究团队在《Discover Oncology》上发表的创新性研究，系统性地探讨了细胞衰老相关基因在皮肤黑色素瘤中的表达模式，并构建了一个能够预测患者预后和免疫治疗反应的基因特征标签。这项研究为理解细胞衰老在黑色素瘤中的作用机制提供了新的视角，也为开发个体化治疗策略奠定了基础。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。他们从TCGA数据库获取了469例SKCM患者的表达数据和临床信息，并从CellAge数据库收集了279个衰老相关基因(SRGs)。通过生物信息学分析，包括差异表达分析、共识聚类、单变量和LASSO Cox回归分析，构建了细胞衰老相关特征(CSRS)。研究还利用TIMER2.0平台的多重算法评估免疫细胞浸润，并通过GSE65904和IMvigor210队列进行外部验证。实验部分采用免疫组化(IHC)验证基因表达，并通过体外细胞实验（包括siRNA转染、CCK-8和EdU实验）探讨RUVBL2的功能作用。

3.1. 表征SRGs的表达模式并鉴定SKCM中的细胞衰老相关亚型

研究团队首先鉴定了SKCM样本与正常皮肤样本之间的7，896个差异表达基因(DEGs)，其中与279个SRGs取交集后获得113个差异表达的SRGs（68个上调，45个下调）。富集分析显示这些基因主要参与细胞衰老和细胞周期相关通路。通过共识聚类分析，患者被分为三个具有明显预后差异的分子亚型，其中Cluster 1预后最差。

3.2. SKCM中CSRS的开发和验证

通过单变量Cox分析鉴定出15个与总生存期(OS)显著相关的SRGs，随后利用LASSO Cox回归进一步筛选出12个基因构建CSRS。风险评分公式基于这些基因的表达水平计算，将患者分为高风险和低风险组。生存分析显示高风险组OS显著缩短，时间依赖性ROC曲线证实了CSRS的预测能力。多变量Cox回归证明风险评分是SKCM的独立预后因素，并在外部数据集GSE65904中成功验证。

3.3. CSRS与临床病理因素的相关性

研究发现Breslow厚度>3毫米和有淋巴转移的患者风险评分显著更高。在不同临床亚组中，高风险患者均表现出较差的生存结果，证明CSRS是一个稳健可靠的预后预测指标。

3.4. 特征基因分析

对12个特征基因的分析显示，在SKCM组织中，MVK、ITSN2、CBX7、NOTCH3、SFN、BCL6和NDRG1显著下调，而FOXM1、RUVBL2和HK3显著上调。泛癌分析显示FOXM1、SFN和RUVBL2是多种癌症的风险因素。

3.5. 特征基因的生物学过程分析

高风险组和低风险组之间的差异表达基因主要富集于免疫相关过程，如免疫应答、T细胞活化和B细胞活化。GSEA显示高风险组主要富集于肿瘤相关通路，包括氧化磷酸化、IFN-γ反应、MYC靶标等。

3.6. CSRS与SASP改变的关联

研究发现高风险组中多种SASP因子（包括白细胞介素、趋化因子、生长因子和蛋白酶）表达显著降低，提示高风险患者可能因SASP活性降低而出现免疫监视功能受损。

3.7. CSRS与肿瘤免疫微环境(TIME)的关联

免疫浸润分析显示，与低风险组相比，高风险组的B细胞和CD8+⁺ T细胞浸润显著减少，而癌症相关成纤维细胞(CAFs)增加。ssGSEA进一步证实高风险组的免疫细胞浸润和免疫相关通路活性较低。ESTIMATE算法显示高风险组具有较低的免疫评分、基质评分和估计评分，但肿瘤纯度较高。

3.8. CSRS与免疫治疗疗效的关联

低风险组中大多数免疫检查点基因表达显著上调。生存分析显示，无论PD-L1、PD-1和CTLA-4表达水平如何，低风险患者均有更长的OS。IPS分析表明低风险患者更可能从免疫检查点抑制剂治疗中获益。在IMvigor210队列中的验证进一步证实了CSRS对免疫治疗反应的预测价值。

3.9. SKCM组织中特征基因表达的验证

IHC分析验证了FOXM1和NOX4在SKCM组织中显著上调，而NOTCH3表达明显下调，与生物信息学分析结果一致。

3.10. RUVBL2促进SKCM的肿瘤发生

体外实验证明RUVBL2在SKCM细胞系中显著上调，其敲低可通过CCK-8和EdU实验证实抑制细胞增殖，表明RUVBL2在SKCM肿瘤发生中起促进作用。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次建立了与SKCM免疫治疗结果相关的CSRS，同时揭示了SASP介导的衰老在促进抗肿瘤免疫中的潜在有益作用。CSRS作为一个稳健的预后和预测生物标志物，突出了细胞衰老在塑造肿瘤免疫微环境和指导治疗策略中的相关性。

研究的重大意义在于将细胞衰老生物学与TIME分析全面整合，跨越多个大型队列，为理解SRGs在黑色素瘤进展和治疗反应中的作用提供了新视角。特别是发现高水平细胞衰老可能通过SASP依赖性机制刺激免疫监视并增强肿瘤抑制，这一发现挑战了传统上认为衰老主要促进肿瘤发生的观点。

然而，研究也存在一定局限性。CSRS模型来源于回顾性批量转录组数据，代表了肿瘤、基质和免疫区室的混合信号，这种固有的异质性限制了对细胞类型特异性解释。未来的研究需要整合单细胞RNA-seq数据和采用患者来源或体内模型，以更精确地剖析SRGs在黑色素瘤进展和治疗反应中的作用。

总之，这项研究建立的CSRS可用于SKCM的预后预测，揭示了SRGs与TIME在SKCM中相互作用的新见解，为临床诊断和治疗干预提供了潜在的分子靶点。这些发现不仅增进了我们对细胞衰老在黑色素瘤中作用的理解，也为开发更有效的个体化治疗策略奠定了基础。随着对肿瘤微环境认识的不断深入，将衰老生物学与免疫治疗相结合的研究方向，有望为黑色素瘤患者带来新的治疗希望。