REEP1的积累会破坏内质网的完整性，并导致远端遗传性运动神经病变中的脊髓运动神经元退化

《Advanced Science》：REEP1 Accumulation Disrupts ER Integrity and Drives Spinal Motoneuron Degeneration in Distal Hereditary Motor Neuropathy

　　内存不足导致的神经退行性变机制研究 摘要：通过建立不同敲除和敲入小鼠模型，发现REEP1基因缺失导致皮质运动神经元退化，而exon5缺失变体因泛素化降解受阻，异常蛋白在脊髓内积累引发内质网碎片化，最终导致远端运动神经病。质谱鉴定HUWE1为REEP1的E3泛素连接酶，结构模拟显示exon5缺失蛋白仍具有膜曲率诱导能力。

　　### REEP1在神经元功能与疾病中的角色

在细胞内，内质网（ER）作为最大的细胞器之一，承担着多种重要功能，包括膜蛋白和分泌蛋白的共翻译合成、脂质和脂滴的合成、钙离子（Ca2?）储存、膜供应用于自噬体形成等。这些功能使得神经元对ER的依赖性远高于其他细胞类型，因为神经元的表面积和细胞质体积都较大，需要高效率的膜蛋白和脂质合成。因此，ER不仅是神经元维持正常功能的关键结构，还延伸至远端的细胞器，如树突和轴突。在轴突中，ER主要由长而少分支的管状结构组成，常与膜片状结构相伴随。

神经元的结构和功能高度依赖于ER的形态和动态变化，这些变化对于维持细胞膜的结构和功能至关重要。然而，当涉及某些基因突变时，ER的结构异常可能会导致神经退行性疾病的发生。例如，REEP1的丧失功能会导致Hereditary Spastic Paraplegia（HSP）的出现，这是一种由于皮质运动神经元轴突退行性变而引起的运动功能障碍疾病。而REEP1基因的特定剪接位点突变（如c.304-2A>C）则会导致 exon5 的删除，从而引发一种称为远端遗传性运动神经元病（dHMN）的疾病，其特点是远端肢体肌肉的缓慢进展性无力和萎缩，但不伴随痉挛症状。

### REEP1的结构与功能

REEP1属于REEP蛋白家族，该家族在脊椎动物中分为两个分支：REEP1–4 和 REEP5–6。在酵母中，这一家族仅有一个祖先蛋白Yop1。REEP5和REEP6的结构特征包括四个跨膜（TM）结构域，后接一个保守的C端疏水性螺旋（AH）。相邻的TM螺旋折叠成一个类似跨膜发夹结构的楔形结构，当插入膜中时，可以诱导高度的局部膜曲率。这种特性在REEP蛋白和其他进化上相关的Reticulon蛋白（RTNs）中均可见。因此，这些膜结构也被称为Reticulon同源结构域（RHDs）。

在人类中，REEP1–4缺乏第一个跨膜结构域，而TM2–4和AH结构域仍然存在。REEP1及其同源蛋白与多种功能相关，包括ER形态发生、脂滴形成、有丝分裂期间的ER动态变化、核孔形成以及裂殖酵母中的自噬。最近的研究发现，REEP1在一种独特的囊泡状ER衍生结构中高度富集。虽然这些囊泡来源于ER的主体，但其具体功能仍不清楚。这些囊泡通过与ER亚结构融合而被回收，这一过程需要REEP1与Atlastins（一种膜结合的GTP酶）形成物理复合物，而Atlastins负责ER管状结构的连接和融合，形成多边形ER网络的三联接结构。

### REEP1突变导致的疾病差异

尽管REEP1的结构和功能已被广泛研究，但其与HSP和dHMN等神经退行性疾病的分子机制仍不完全清楚。先前的研究表明，同源缺失（KO）小鼠表现出与HSP一致的表型，即皮质运动神经元轴突的长度依赖性退行性变。为了研究dHMN的病理机制，我们构建了与dHMN相关的REEP1剪接位点突变c.304-2A>C的KI小鼠模型。通过将loxP位点插入到内含子4，并将新霉素选择性基因盒插入到内含子5，我们成功建立了该模型。随后，通过Cre重组酶的临时表达，我们去除了内含子5及其选择性基因盒，最终获得了带有Δexon5变异的KI小鼠。

在KI小鼠中，我们观察到与dHMN一致的运动功能障碍。例如，KI/KI小鼠在6个月龄时表现出前肢力量减弱的迹象，其坠落时间显著缩短。我们还测量了KI/KI小鼠后肢足底角度（FBA）的变化，发现其在3个月龄时首次出现显著下降，而WT/KI小鼠的FBA则在之后逐渐变平。此外，在旋转杆测试中，KI/KI小鼠的坠落时间也显著减少，表明其运动能力受损。这些结果表明，同源和异源的KI小鼠均表现出与dHMN相符的运动功能障碍，而症状的严重程度和出现时间在同源KI小鼠中更为明显。

### 神经元的形态学变化

为了进一步理解REEP1突变对神经元的影响，我们分析了KI/KI小鼠和KO/KO小鼠的神经元形态学变化。在KO/KO小鼠中，我们观察到皮质运动神经元的显著减少，这与之前的研究一致。而在KI/KI小鼠中，皮质运动神经元的数量未受影响，但脊髓运动神经元表现出明显的退行性变化。通过透射电镜（TEM）分析，我们发现KO/KO小鼠的皮质运动神经元的ER结构更为复杂，表现为ER管状结构的长度增加，但数量减少。相比之下，KI/KI小鼠的脊髓运动神经元的ER结构呈现出碎片化，这可能与ER的过度塑形有关。

我们还发现，KI/KI小鼠的脊髓运动神经元中存在大量的CD68阳性巨噬细胞，这可能是神经元退行性变的免疫反应标志。此外，KI/KI小鼠的骨骼肌纤维出现聚集性萎缩，且肌纤维直径减小，细胞核向中心迁移，这些变化与脊髓运动神经元的退行性变相关。而KO/KO小鼠则未表现出这些变化，表明脊髓运动神经元的退行性变与Δexon5变异有关。

### Δexon5变异的膜重塑能力

为了研究Δexon5变异对膜重塑能力的影响，我们通过分子动力学模拟和脂质体重塑实验进行了分析。结果表明，Δexon5变异保留了膜重塑能力，能够诱导膜的局部曲率变化。这与我们对突变蛋白的建模和模拟结果一致，显示其能够维持膜的结构变化。然而，与野生型（WT）蛋白相比，Δexon5变异的膜曲率诱导能力略有减弱，这可能与其较短的C端疏水性螺旋有关。

此外，我们还发现，Δexon5变异在体内表现出更高的丰度，特别是在脊髓和坐骨神经中。这可能与Δexon5变异的降解机制受损有关，因为其关键的泛素化位点（如K123和K139）的泛素化能力下降，导致其在ER中积累。这种积累可能通过影响ER的结构稳定性，最终导致ER的碎片化和脊髓运动神经元的退行性变。

### REEP1的泛素化与降解

通过泛素化实验，我们发现WT REEP1蛋白在HEK-293T细胞中被强烈泛素化并降解，而Δexon5变异的泛素化能力显著下降。这种泛素化能力的差异可能解释了其在ER中的积累现象。为了确定REEP1的泛素化酶，我们进行了蛋白质组学分析，发现HUWE1是负责REEP1降解的E3泛素连接酶。通过siRNA介导的HUWE1敲低实验，我们验证了这一发现，发现HUWE1的减少显著降低了REEP1的泛素化水平。

此外，我们还发现，其他与dHMN相关的REEP1变异（如L96P和L118R）也表现出泛素化能力的下降，而与HSP相关的变异（如P19L和T55K）则保留了泛素化能力。这表明，泛素化能力的下降可能是dHMN发生的关键因素，而保留泛素化能力的变异则可能更倾向于通过蛋白酶体途径降解，从而避免ER的过度塑形和碎片化。

### 与dHMN相关的REEP1变异的泛素化与蛋白积累

通过比较WT和Δexon5变异在不同细胞类型中的表达情况，我们发现Δexon5变异在脊髓和坐骨神经中的丰度显著增加。这可能与Δexon5变异的泛素化能力下降有关，导致其在ER中积累。这种积累可能通过影响ER的结构稳定性，最终导致ER的碎片化和脊髓运动神经元的退行性变。

此外，我们还发现，与dHMN相关的其他变异（如L96P和L118R）在泛素化能力上也表现出下降，而与HSP相关的变异则保留了泛素化能力。这表明，泛素化能力的下降可能是dHMN发生的关键因素，而保留泛素化能力的变异则可能更倾向于通过蛋白酶体途径降解，从而避免ER的过度塑形和碎片化。

### 与dHMN相关的REEP1变异的蛋白相互作用

通过研究REEP1的互作组，我们发现HUWE1是其泛素化的主要E3连接酶。HUWE1的缺失显著降低了REEP1的泛素化水平，表明其在REEP1的降解中起关键作用。此外，我们还发现，与dHMN相关的其他变异（如L96P和L118R）同样表现出与HUWE1的互作减少，这进一步支持了HUWE1在dHMN发病机制中的作用。

在KO/KO小鼠中，我们未观察到与dHMN相关的变异，这可能是因为其泛素化能力未受影响，导致REEP1蛋白正常降解，从而避免了ER的过度塑形和碎片化。而在KI/KI小鼠中，Δexon5变异的泛素化能力下降，导致其在ER中积累，最终引发脊髓运动神经元的退行性变。

### 结论与展望

综上所述，Δexon5变异保留了REEP1的膜重塑能力，但由于泛素化能力下降，导致其在ER中积累，进而引发脊髓运动神经元的退行性变。这种积累可能通过影响ER的结构稳定性，导致ER的碎片化和脊髓运动神经元的死亡。此外，其他与dHMN相关的REEP1变异也表现出类似的泛素化能力下降，这表明泛素化能力的下降可能是dHMN发生的关键机制。

未来的研究可以进一步探讨这些变异在不同神经元类型中的具体作用机制，以及它们如何影响ER的动态变化。此外，研究这些变异在其他神经退行性疾病中的潜在作用，可能有助于理解更广泛的神经退行性疾病的发病机制。通过这些研究，我们希望能够为相关疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。