宿主细胞KRT-18作为微小隐孢子虫PDI的非氧化还原依赖性互作因子促进寄生虫感染

《Communications Biology》：Host cell KRT-18 as a non-redox dependent interactor of Cryptosporidium parvum PDI enables parasite infection

　　本研究针对微小隐孢子虫(C. parvum)感染机制不清的问题，揭示了其蛋白二硫键异构酶(CpPDI)通过与宿主细胞角蛋白18(KRT-18)发生非氧化还原依赖性互作，促进寄生虫入侵的新机制。该发现为开发抗隐孢子虫病新策略提供了潜在靶点。

　　

在全球范围内，隐孢子虫是导致人类和动物腹泻病的主要肠道原虫寄生虫之一。尤其令人担忧的是，隐孢子虫病是5岁以下儿童严重腹泻病的重要诱因，每年导致数万儿童死亡。目前唯一获得美国FDA批准的治疗药物硝唑尼特对免疫缺陷或营养不良个体效果有限，且不适用于2岁以下儿童，而有效疫苗的研发仍面临挑战。因此，深入探究隐孢子虫的生物学特性及其与宿主的相互作用机制，对于开发新的治疗策略至关重要。

微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)作为一种顶复门寄生虫，其生活史包括有性生殖和无性生殖阶段，整个周期在单一宿主体内完成。与其他顶复门寄生虫不同，隐孢子虫寄生于宿主肠上皮细胞内，但位于一个独特的细胞内但胞质外的生态位中。这种特殊寄生位置的形成机制尚不完全清楚，但普遍认为与宿主肌动蛋白细胞骨架的重排密切相关。

在这一背景下，河南农业大学张龙现和张素梅团队在《Communications Biology》上发表了题为"宿主细胞KRT-18作为微小隐孢子虫PDI的非氧化还原依赖性互作因子促进寄生虫感染"的研究论文，系统阐明了CpPDI在隐孢子虫入侵过程中的关键作用及分子机制。

研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建内源性标签菌株；通过免疫荧光显微镜观察蛋白定位；采用GST-pull down联合LC-MS/MS技术筛选互作蛋白；使用免疫共沉淀验证蛋白相互作用；建立体外感染模型评估寄生虫负荷；进行分子对接分析预测结合位点。研究样本包括体外培养的HCT-8细胞和IFN-γ^-/-基因敲除小鼠感染模型。

CpPDI的鉴定与定位

研究人员首先通过系统发育分析发现，CpPDI(由cgd6_120基因编码)与其他顶复门寄生虫中与寄生虫粘附和入侵相关的PDIs最为相似。该蛋白包含信号肽和两个保守的硫氧还蛋白结构域，其催化结构域为CGHC。通过CRISPR/Cas9技术构建内源性标签菌株，发现CpPDI主要定位于孢子体的内质网和细胞质中。重要的是，在隐孢子虫入侵宿主细胞过程中，CpPDI从入侵的孢子体分泌到宿主细胞中，表明其在早期感染阶段可能发挥关键作用。

CpPDI的表达特征

通过逆转录定量PCR和免疫荧光分析，研究人员发现CpPDI在感染早期(2、6和12小时)高表达，而在后期阶段(24、36、48和72小时)表达较低。在体内实验中，感染C. parvum7天的小鼠小肠组织分析显示，CpPDI与Vicia villosa lectin(VVL)共定位，进一步证实了其在感染过程中的活跃表达。

CpPDI功能验证

为探究CpPDI的生物学功能，研究人员使用抗CpPDI抗体和PDI抑制剂(杆菌肽和DNTB)进行体外中和实验，发现这些处理均能显著抑制孢子体对宿主细胞的入侵。此外，通过构建催化活性位点突变体(CpPDI-AAAA)，证明重组CpPDI能促进寄生虫入侵，而突变体则表现出抑制作用，进一步证实了CpPDI在寄生虫-宿主相互作用中的关键角色。

CpPDI与KRT-18的相互作用

通过GST-pull down联合LC-MS/MS分析，研究人员筛选到17个潜在的CpPDI相互作用底物，其中角蛋白18型细胞骨架蛋白(KRT-18)因与隐孢子虫入侵相关的细胞膜和细胞骨架功能相关而被选为重点研究对象。免疫共沉淀实验证实，CpPDI与KRT-18在体内存在相互作用，且这种相互作用不受还原剂二硫苏糖醇(DTT)的影响，表明其为非氧化还原依赖性。分子对接研究预测了CpPDI和KRT-18的结合位点，进一步支持了它们的直接相互作用。

KRT-18在感染中的作用

研究人员通过小干扰RNA(siRNA)敲低HCT-8细胞中KRT-18的表达，发现寄生虫负荷在感染后3和24小时显著降低，表明KRT-18的表达抑制主要阻碍了寄生虫的粘附和入侵过程。免疫荧光分析显示，在寄生虫感染过程中，KRT-18与CpPDI在感染部位共定位，进一步支持了它们在功能上的相关性。

本研究系统阐明了CpPDI作为隐孢子虫入侵过程中的关键效应蛋白，通过非氧化还原依赖性方式与宿主细胞KRT-18相互作用，促进寄生虫感染的分子机制。这一发现不仅深化了对隐孢子虫与宿主相互作用机制的理解，而且为开发针对隐孢子虫病的新治疗策略提供了潜在靶点。特别值得注意的是，CpPDI特异性抗体和抑制剂能够有效抑制细胞入侵，表明CpPDI可能成为抗隐孢子虫药物开发的 promising target。随着隐孢子虫遗传操作工具的不断发展，未来对CpPDI功能的深入研究将为进一步揭示其生物学角色提供新的视角。