集成免疫磁分离与过氧化氢酶抑制比色法用于金黄色葡萄球菌的快速可视化检测

《LWT》：Integrated Immunomagnetic Separation and Catalase-Inhibited Colorimetry for Rapid Visual Detection of Staphylococcus aureus

　　快速检测金黄色葡萄球菌的方法研究

　　金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）作为一种重要的食源性病原体，长期以来对全球食品安全构成了严重威胁。由于其能够引起多种疾病，包括胃肠炎、皮肤感染、肺炎和心内膜炎等，因此对它的快速、准确检测具有重要的现实意义。在食品行业中，传统检测方法往往存在耗时、操作复杂以及难以适应现场快速检测等缺点，限制了其在实际应用中的推广。为了克服这些局限，研究者们不断探索新的检测技术，以期实现更高效、便捷和高灵敏度的检测手段。本研究提出了一种结合免疫磁分离技术（IMS）和基于细胞内过氧化氢酶活性的抑制显色系统的新方法，为食源性病原体的快速筛查提供了可行的解决方案。

### 1. 研究背景与重要性

金黄色葡萄球菌广泛存在于自然环境中，尤其是在食品生产与加工过程中，它很容易污染乳制品、肉类及各类高风险食品。例如，牛奶、奶酪、冰淇淋等都可能成为其滋生和传播的载体。由于其具有较强的环境适应性，例如耐高温、耐低湿度和对pH值变化不敏感，金黄色葡萄球菌能够在多种条件下存活并传播。此外，它还具有通过空气传播的潜力，因为其能够附着在人体皮肤和鼻腔等部位，并通过接触或空气传播到食品中。因此，开发一种能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌的方法，对于保障食品安全、减少疾病传播具有重要意义。

金黄色葡萄球菌的检测通常依赖于传统的培养方法，这种方法虽然具有较高的准确性，但其耗时较长，通常需要数天时间才能获得结果，这在紧急情况或现场检测中显得不够高效。近年来，随着分子生物学技术的发展，一些基于PCR和核酸扩增的检测方法被广泛应用，这些方法能够在短时间内检测到目标病原体。然而，这些技术往往需要昂贵的设备和专业的操作人员，限制了其在基层或现场环境中的使用。因此，开发一种操作简便、无需复杂仪器、能够在现场快速检测金黄色葡萄球菌的方法，成为食品安全领域的一个重要研究方向。

在众多检测方法中，过氧化氢酶试验因其简便性和低成本而被广泛使用。该试验基于金黄色葡萄球菌能够分解过氧化氢（H?O?）并释放氧气的特性，通过观察气泡的形成来判断是否存在该菌。然而，这种方法的一个主要缺陷是其缺乏特异性，因为许多其他细菌，如大肠杆菌（*Escherichia coli*）和李斯特菌（*Listeria monocytogenes*）也能够产生过氧化氢酶，从而导致误判。此外，当细菌浓度较低或样品基质复杂时，气泡的形成难以被肉眼清晰观察，这进一步限制了该方法的实际应用。

为了解决这些问题，本研究引入了一种新的检测策略，即通过结合免疫磁分离技术和基于过氧化氢酶活性的抑制显色系统，实现对金黄色葡萄球菌的快速、直观检测。这种方法不仅提高了检测的特异性，还使得结果更容易被肉眼观察，从而适用于现场快速筛查。此外，该方法还简化了样品预处理步骤，无需依赖复杂的实验设备或专业的技术人员，使得检测过程更加便捷和经济。

### 2. 技术原理与方法创新

本研究的核心技术是免疫磁分离技术（IMS）和基于过氧化氢酶活性的显色系统。IMS是一种利用磁性纳米颗粒（MNPs）与特定抗体结合，从而实现对目标细菌的高效分离和富集的技术。通过将抗体与磁性纳米颗粒结合，形成具有特异性识别能力的“捕获探针”，IMS能够在复杂的食品基质中快速、高效地分离出目标细菌。这一技术不仅减少了样品预处理的时间，还降低了交叉污染的风险，提高了检测的准确性。

在显色系统方面，研究者采用了一种基于过氧化氢酶活性的抑制反应。具体而言，当金黄色葡萄球菌存在于样品中时，其细胞内的过氧化氢酶能够催化H?O?的分解，生成氧气和水。然而，这种反应会抑制TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）与HRP（辣根过氧化物酶）的显色反应，导致显色强度下降。通过观察这种颜色变化，可以直观地判断样品中是否存在金黄色葡萄球菌。相比于传统的过氧化氢酶试验，这种方法不仅避免了气泡形成的干扰，还使得检测结果更加稳定和易于观察。

为了提高检测的灵敏度和特异性，研究者还对整个检测流程进行了优化。例如，在IMS步骤中，通过调整磁性纳米颗粒的浓度和与细菌的反应时间，确保能够高效地富集目标细菌。在显色反应中，研究者通过调整TMB和HRP的浓度以及H?O?的反应时间，使得颜色变化更加明显，从而提高检测的灵敏度。此外，通过使用鸡卵黄免疫球蛋白Y（IgY）替代传统的动物源抗体，不仅降低了对动物的依赖，还提高了检测的稳定性和经济性。

### 3. 实验设计与优化过程

为了验证新方法的可行性，研究者首先对IgY的纯度和特异性进行了评估。通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）和间接ELISA（酶联免疫吸附测定）等方法，研究者确认了IgY能够特异性地识别金黄色葡萄球菌，并且具有较高的纯度和结合能力。此外，研究者还通过FTIR（傅里叶变换红外光谱）和磁滞回线测试等方法，对磁性纳米颗粒的化学特性及其磁响应能力进行了分析，确保其能够有效地与IgY结合并保持良好的磁性性能。

在实验过程中，研究者还对磁性纳米颗粒的制备工艺进行了优化。通过使用三氯化铁（FeCl?·6H?O）和柠檬酸作为稳定剂，研究者成功制备出具有羧基修饰的磁性纳米颗粒。这些纳米颗粒能够与IgY发生共价结合，形成具有高特异性识别能力的捕获探针。通过TEM（透射电子显微镜）观察，研究者确认了磁性纳米颗粒的形态和大小，以及IgY在其表面的分布情况。结果显示，IgY能够有效地覆盖磁性纳米颗粒的表面，从而增强其对目标细菌的捕获能力。

在检测流程的优化过程中，研究者通过调整反应条件，如H?O?的浓度、反应时间、TMB和HRP的浓度等，使得显色反应更加敏感和稳定。例如，在H?O?浓度为0.2 mM的情况下，显色反应的差异最大，表明该浓度能够有效抑制过氧化氢酶活性。此外，当反应时间为2分钟时，显色效果最佳，说明该时间能够充分释放H?O?分解产物，从而最大程度地影响显色反应。通过这些优化步骤，研究者确保了整个检测流程的稳定性和准确性。

### 4. 检测性能与应用潜力

本研究中开发的新方法在多个方面表现出色。首先，其检测灵敏度较高，能够在牛奶样品中检测到每毫升103 CFU（菌落形成单位）的金黄色葡萄球菌。这一灵敏度满足了当前食品安全标准（GB 29921-2013）的要求，表明该方法在实际应用中具有很高的可行性。其次，该方法的检测时间较短，整个流程可在75分钟内完成，远低于传统方法所需的数小时甚至数天时间，这对于现场快速检测具有重要意义。

此外，该方法还具有良好的特异性。在与其他常见食源性病原体（如大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和李斯特菌）的检测实验中，只有金黄色葡萄球菌表现出显著的颜色变化，其他细菌则没有明显的反应。这表明该方法能够有效区分金黄色葡萄球菌与其他过氧化氢酶阳性细菌，从而提高了检测的准确性。研究者还通过重复实验验证了该方法的稳定性和可重复性，结果表明在不同时间点和不同批次的实验中，检测结果具有良好的一致性，说明该方法具有较高的可靠性。

在实际样品检测中，研究者使用了纯牛奶作为模拟基质，并在其中加入不同浓度的金黄色葡萄球菌。实验结果表明，该方法能够有效检测出每毫升103 CFU的细菌，并且在牛奶样品中表现出良好的检测性能。这进一步证明了该方法在实际应用中的潜力，尤其是在食品生产和流通环节中，可以用于快速筛查可能受到污染的食品。

### 5. 研究意义与未来展望

本研究提出了一种结合免疫磁分离技术和过氧化氢酶活性抑制显色系统的新方法，为金黄色葡萄球菌的快速检测提供了可行的解决方案。该方法不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还简化了操作流程，使得检测过程更加便捷和经济。相比于传统的过氧化氢酶试验，该方法避免了气泡形成的干扰，使得结果更容易被肉眼观察，适用于现场快速筛查。

此外，该方法还具有良好的适应性。通过更换抗体，该平台可以用于检测其他过氧化氢酶阳性病原体，如沙门氏菌、大肠杆菌等。这种灵活性使得该方法不仅适用于金黄色葡萄球菌的检测，还可以推广到其他食源性病原体的筛查中。因此，该方法具有广泛的应用前景，有望成为食品安全监测的重要工具。

未来的研究可以进一步探索该方法的优化空间，例如通过引入人工智能（AI）技术，提高检测的自动化水平和数据处理能力。此外，还可以考虑将其与其他检测技术相结合，如分子生物学方法或生物传感器技术，以进一步提高检测的准确性和效率。通过这些技术的整合，可以实现更高效、更智能化的食品安全监测系统，为食品安全保障提供更加有力的技术支持。