孟德尔随机化揭示精神分裂症风险增强子RNA：ZNF135介导的调控新机制与RGS6e功能验证

《Molecular Psychiatry》：Mendelian randomization facilitates identification of schizophrenia risk enhancer RNAs

　　本研究利用BrainSeq数据构建71,022个增强子RNA（eRNA）的表达数量性状位点图谱，通过整合精神分裂症（SZ）GWAS数据开展基于摘要数据的孟德尔随机化（SMR）分析，鉴定出61个SZ风险相关转录非编码增强子（TNE），发现表型与基因型对TNE表达的贡献呈负相关（r=-0.78）。研究进一步揭示转录抑制因子ZNF135在SZ患者中下调，并通过实验验证RGS6e通过反式作用机制调控神经系统基因表达、促进神经元分化，从而降低SZ风险。该研究为阐明增强子及其转录产物在精神分裂症中的作用提供了新视角。

　　

精神分裂症是一种复杂的多基因遗传性疾病，全球数百万人受其影响。近年来，大规模全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出大量与精神分裂症相关的遗传易感位点，这些位点显著富集在基因调控的重要元件——增强子区域。增强子通过启动远程染色质环化等机制调控基因表达，其自身亦能转录产生增强子RNA（eRNA）。eRNA的表达水平可直接反映增强子活性，并可能通过调控染色质构象或与转录因子相互作用参与基因表达调控。然而，eRNA在精神分裂症发病机制中的具体作用，尤其是其表达变化与疾病风险之间的因果关系，仍不清楚。由于增强子活性易受环境因素、细胞状态等背景干扰，传统的差异表达分析难以区分因果与关联。因此，亟需一种能有效控制混杂因素的方法来揭示eRNA与精神分裂症之间的内在联系。

为解决上述问题，南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室赵存友、熊富和王忠举团队在《Molecular Psychiatry》上发表了最新研究。该研究利用BrainSeq计划Phase 1数据集中的背外侧前额叶皮层（DLPFC）样本，针对多巴胺能神经元来源的71,022个转录非编码增强子（TNE），构建了祖先分层（欧洲样和非洲样人群）的顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）图谱。通过将欧洲样人群的eQTL摘要统计数据与精神分裂症 Psychiatric Genomics Consortium（PGC3）GWAS的欧洲人群数据整合，应用基于摘要数据的孟德尔随机化（SMR）方法，推断TNE表达与精神分裂症风险之间的因果关系。同时，进行差异表达（DE）分析以比较表型效应与基因型效应的异同。研究还通过转录因子 motif 富集分析、基因表达相关性分析、逐步回归统计模型以及细胞实验（如慢病毒过表达、神经元分化 assay）等多重手段，深入探索了关键调控因子ZNF135和候选增强子RNA RGS6e的功能机制。

研究团队首先对BrainSeq队列中456例具有匹配基因型的DLPFC样本（295例对照，161例精神分裂症患者）进行RNA-Seq数据分析，量化了71,022个TNEs的表达。随后，在欧洲样（n=222）和非洲样（n=234）人群中分别进行cis-eQTL分析（SNP与TNE距离±1 Mb），分别鉴定出715,951和195,940个显著的eQTL对。量化-量化图显示eQTL P值显著偏离预期分布，表明遗传变异与TNE表达之间存在强关联信号。

对显著eQTL的特征分析发现，随着eQTL P值的降低，eSNP与TNE之间的距离缩短，PGC3-SZ GWAS效应值增大，GWAS关联显著性增强。染色质状态富集分析显示，显著eQTL在二价染色质侧翼区域（BivFlnk，同时具有H3K4me3和H3K27me3修饰）逐渐富集，提示靠近二价增强子和启动子的SNP在调控TNE表达中起重要作用。

SMR分析在欧洲样人群中鉴定出61个与精神分裂症风险相关的TNEs（FDR < 0.05）。差异表达分析在PGC3-SZ位点内发现了228个与精神分裂症相关的差异表达TNEs。值得注意的是，在61个SMR鉴定的风险TNEs中，有19个也在DE分析中显著。对这19个重叠TNEs的分析发现，DE分析中的效应值（Log2FC）与SMR估计值（β_SMR）呈显著负相关（r = -0.57, P = 0.01）。进一步分析表明，对于效应方向不一致的TNEs，表型效应（病例-对照表达差异）与基因型效应（top eQTL SNP效应）呈显著负相关（r = -0.78, P = 2.96E-3），而效应方向一致的TNEs则无此相关性（r = 0.03, P = 0.95）。表型与基因型的交互项不显著，表明表型对TNE表达的影响独立于基因型效应。这种不一致性在lincRNAs中未观察到。

为探究导致TNE表达中表型与基因型效应不一致的非遗传因素，研究人员进行了敏感性分析，排除了吸烟相关变量的主要影响。随后，他们对12个效应方向相反的TNEs进行了转录因子 motif 富集分析，发现ZNF135、ZNF460和ZNF384 motif 显著富集。表达分析显示，ZNF135和ZNF460在精神分裂症患者中显著下调。

对ZNF135附近SNPs的分析发现，其GWAS效应值与ZNF135 eQTL效应值呈负相关（r = -1, P = 1.80E-2），提示ZNF135表达升高可降低精神分裂症风险，这与DE分析中ZNF135下调增加风险的结果一致。基因表达相关性及基因本体论（GO）富集分析显示，与ZNF135表达负相关的基因显著富集于突触和树突相关细胞组分（GO-CC）。在ZNF135过表达的A549细胞系中，下调基因也富集于突触和神经元投射通路，支持ZNF135作为神经系统相关基因（包括突触相关基因）的转录抑制因子。进一步分析发现，具有ZNF135 motif 匹配的TNEs，其表达与ZNF135呈负相关，与无motif匹配的TNEs存在显著差异。将ZNF135表达作为协变量进行敏感性分析，显著降低了表型效应大小，表明ZNF135是精神分裂症相关转录组变化的重要混杂因素。

在具有ZNF135 motif 匹配的TNEs中，chr14:72448647-72451627（位于RGS6基因内含子区，命名为RGS6e）和chr1:150281924-150282208在P值校正后仍与ZNF135表达负相关。逐步回归分析表明，RGS6e的表达同时受top SNP rs2283424基因型和ZNF135表达的显著影响，但两者交互作用不显著，提示遗传变异和ZNF135表达对RGS6e的调控是独立的。

RGS6e的eQTL与PGC3-SZ易感位点共定位。SMR分析表明，RGS6e表达增加显著降低精神分裂症风险（P = 3.86E-4），而DE分析显示其在患者中表达升高（P = 4.20E-12）。由于RGS6e附近500 kb内未发现蛋白编码基因的显著eQTL，研究人员推测RGS6e转录本本身可能发挥功能。他们在SK-N-SH细胞中过表达RGS6e的正向（Fw）和反向互补（Rc）转录本，转录组分析发现，Fw和Rc过表达诱导的差异表达基因（DEG）均不位于RGS6e附近，提示其可能通过反式作用机制调控基因表达。共有60个上调基因和23个下调基因在Fw和Rc条件下共享。上调基因集显著富集于抑郁障碍相关通路。功能上，全反式维甲酸（ATRA）诱导的神经元分化实验表明，过表达RGS6e Fw或Rc均能显著增加SK-N-SH细胞的神经突长度，促进神经元分化。

本研究构建了大规模、祖先分层的TNE eQTL图谱，揭示了SNP对TNE表达的重要调控作用，特别是在二价染色质区域。通过整合SMR与DE分析，研究发现增强子RNA的表达更易受背景因素影响，并识别出表型效应与基因型效应对TNE表达的独立贡献，尤其是方向相反的现象。ZNF135被鉴定为关键的上游调控因子，其在精神分裂症中的下调导致携带其motif的TNEs（如RGS6e）去抑制，部分解释了DE与SMR结果间的差异。功能实验证实RGS6e通过反式作用上调神经系统相关基因、促进神经元分化，从而发挥保护作用，这与SMR结果一致，但与传统DE分析观察到的患者中表达升高现象相反，凸显了区分因果与关联在理解疾病机制中的重要性。

该研究的创新之处在于强调了基于eQTL的SMR分析在阐明增强子及其转录产物在疾病中作用的重要性，避免了单纯依赖差异表达分析可能带来的误导。所构建的71,022个TNE的eQTL图谱为研究其他精神疾病或神经退行性疾病中增强子的作用提供了宝贵资源。研究的局限性包括缺乏详细的临床症状和用药史数据，无法系统评估非遗传因素（如抗精神病药物、疾病慢性化）对转录组的影响；对RGS6e发挥功能的具体分子机制有待进一步深入探索。

总之，该研究通过多组学整合分析与实验验证，深入揭示了增强子RNA在精神分裂症发病中的复杂调控网络，特别是ZNF135-RGS6e轴的作用，为理解精神分裂症的遗传和表观遗传机制提供了新的见解，并为未来开发新的治疗策略指明了潜在靶点。