通过FNDC5/Irisin通路，利用富含发酵后的Hypholomine B的Sanghuangporus sanghuang菌丝体在体外激活棕色脂肪细胞的产热功能

《Molecular and Cellular Endocrinology》：In vitro Activation of Brown Adipocyte Thermogenesis by Fermented Hypholomine B-enriched Sanghuangporus sanghuang Mycelia Through FNDC5/Irisin Pathway

　　抑制肥胖的发酵子实体提取物及活性成分通过FNDC5/irisin通路激活产热并减少脂质积累

　　全球肥胖问题（globesity）正日益成为公共卫生和经济系统的重要挑战。随着研究的深入，越来越多的科学家开始关注通过自然产物或生物活性成分调节脂肪组织代谢，以寻找有效的抗肥胖策略。本研究首次系统地探讨了发酵型**Sanghuangporus sanghuang**菌丝体提取物（SS-IM1）及其新型生物活性化合物**hypholomine B**在棕色脂肪组织激活中的作用。通过使用HEK293细胞和FNDC5启动子-EGFP构建体，以及分化后的3T3-L1脂肪细胞，我们发现这两种成分能够显著增强FNDC5的表达并促进**irisin**的分泌。进一步的研究揭示了它们在促进棕色脂肪形成和激活中的不同机制。SS-IM1表现出更强的**irisin**诱导能力和热生成激活效果，而单独的**hypholomine B**则在减少脂质积累方面展现出前所未有的效果。此外，我们还发现SS-IM1能够通过**GLUT4**的上调显著增强葡萄糖的摄取。这些发现不仅阐明了**S. sanghuang**抗肥胖作用的新型分子机制，也为解决全球肥胖和代谢性疾病问题提供了潜在的治疗候选药物。

肥胖是一种代谢性疾病，其核心特征是能量摄入与消耗之间的失衡。这种失衡不仅增加了心血管疾病、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病和哮喘等相关疾病的风险，还在新冠疫情期间被确认为导致严重并发症的危险因素之一。这些发现表明，肥胖正逐渐成为全球医疗和经济体系中日益严峻的负担。为了应对这一挑战，研究者们提出了多种干预策略，包括生活方式调整、药物治疗以及利用自然产物或功能性食品成分激活体内代谢通路。

在哺乳动物中，存在三种类型的脂肪组织：白色脂肪组织、米色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪细胞主要负责储存能量，以三酰甘油的形式进行能量储备；而棕色和米色脂肪细胞则通过非颤抖产热的方式释放能量，这一过程依赖于高含量的线粒体和**UCP1**（解偶联蛋白1）的表达。**UCP1**的作用是解偶联呼吸链中的电子传递，从而阻断ATP的合成，将能量以热的形式释放出来。研究表明，**UCP1**的活性与产热能力在棕色脂肪细胞中与体重控制和能量稳态密切相关。此外，最近的研究还发现，肥胖个体的**UCP1**表达水平降低，而通过多种环境或药物刺激激活**UCP1**可以改善代谢并发症。因此，促进棕色或米色脂肪细胞的生成被视为治疗肥胖的一种潜在策略。

通常，**UCP1**的表达是通过冷暴露诱导的，这种刺激会激活交感神经系统，促进去甲肾上腺素的分泌，从而激活脂肪组织的产热功能。然而，**irisin**这一新型的肌源性因子和脂肪源性因子（myokine和adipokine）也被发现能够上调**UCP1**的表达并驱动棕色脂肪的形成。**irisin**来源于**FNDC5**（纤维连接蛋白III结构域含蛋白5）的胞外部分被切割后产生的产物，其在多种组织中均有表达，包括大脑、心脏、肾脏、肝脏、胃、卵巢和睾丸。文献分析表明，**irisin**不仅能够促进白色脂肪组织的棕色化，还能促进肌肉细胞对葡萄糖的摄取，并影响神经细胞和成骨细胞的分化。此外，研究表明，敲低**FNDC5**基因会导致**UCP1**表达显著降低，同时促进细胞脂质积累，从而增强脂肪生成。因此，利用营养补充剂、功能性食品成分或膳食补充剂刺激内源性**FNDC5/irisin**的生成，可能成为治疗代谢性疾病的一种有效策略，特别是对于那些无法满足日常体力活动需求的个体。

**Sanghuangporus sanghuang**是一种具有重要药用价值的传统药用真菌，在现代药理学研究中被发现具有多种功能，包括免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗菌和抗癌等作用。在这些活性成分中，**hypholomine B**是一种黄色的**styrylpyrone**型多酚，已被证明能够显著减少**oleic**和**palmitic acid**（油酸和棕榈酸）诱导的脂质积累，其作用机制是通过抑制脂生成（如**srebp-1c**）并上调与能量代谢相关的基因（如**ampk**和**pgc-1α**）。此外，我们先前的研究表明，**S. sanghuang**能够激活**Nrf2**（核因子E2相关因子2）信号通路，该通路在调节与抗氧化应激防御相关的基因中起着关键作用。**Nrf2**的激活已被发现能够通过β-肾上腺素受体刺激在脂肪细胞中诱导**UCP1**的表达，并在高脂饮食喂养的肥胖小鼠中增强氧气消耗。进一步的研究还显示，**irisin**能够通过**p62/Nrf2/HO-1**信号通路诱导3T3-L1脂肪细胞的棕色化。

基于这些发现，我们提出假设：富含**hypholomine B**的**S. sanghuang**菌丝体提取物（SS-IM1）可能通过**p62/Nrf2/HO-1**信号通路激活**FNDC5/irisin**通路，从而诱导白色脂肪组织的棕色化。尽管已有研究证实了**S. sanghuang**通过白色脂肪组织调节发挥抗肥胖作用（Feng et al., 2018），但其通过棕色脂肪组织激活的潜在益处尚未被充分研究。因此，本研究将成为首次探讨富含**hypholomine B**的**S. sanghuang**菌丝体提取物和**hypholomine B**本身对3T3-L1细胞中棕色样脂肪细胞形成的影响，并分析其潜在的分子机制。

本研究中，我们首先对富含**hypholomine B**的**S. sanghuang**菌丝体的培养进行了优化。5 mg/g的**hypholomine B**-富集的**S. sanghuang**菌丝体（SS-IM1，SangMAX）的培养方法基于之前的研究，并进行了小幅修改。简要来说，菌种接种后在25°C的条件下培养，培养基包含1.5%（w/v）果糖、0.3%酵母提取物、0.05%硫酸镁和1%（w/v）燕麦粉，并将pH值调整至5。经过7天的培养后，从摇瓶中取出1%的菌种进行扩增，并在500-L的发酵罐中进行大规模培养，温度仍维持在25°C。这一优化的培养方法有助于提高**hypholomine B**的产量，同时确保菌丝体的高质量。

为了研究**FNDC5**的调控机制，我们向HEK293细胞中引入了**FNDC5启动子-EGFP**质粒，以识别能够增强**FNDC5启动子**活性的成分。首先，我们评估了**SS-IM1**提取物的安全性，使用**MTT**实验检测其在200 μg/mL浓度下的细胞毒性，结果显示其对细胞无显著毒性，且处理组与对照组之间无统计学差异（p < 0.05）。这一结果表明，**SS-IM1**提取物在体外环境中是安全的，可以作为进一步研究的潜在药物。

**FNDC5**是一种细胞膜蛋白，能够将**irisin**释放到细胞外空间。通过引入**FNDC5启动子-EGFP**质粒，我们能够更精确地检测**FNDC5**的表达变化。研究结果显示，**SS-IM1**提取物能够显著增强**FNDC5**的表达，并促进**irisin**的分泌。这一发现表明，**SS-IM1**可能通过激活**FNDC5/irisin**通路，进而影响脂肪组织的代谢功能。此外，**hypholomine B**单独作用时也表现出类似的增强**FNDC5**表达的效果，进一步支持其在抗肥胖中的潜在作用。

为了更深入地研究这些成分的作用机制，我们还利用**Seahorse分析**检测了它们对线粒体呼吸和**UCP1**介导的质子泄漏的影响。结果显示，**SS-IM1**和**hypholomine B**均能够显著增强线粒体呼吸能力，并促进**UCP1**介导的质子泄漏，这进一步验证了它们的产热效果。此外，我们还发现，**SS-IM1**能够通过上调**GLUT4**的表达显著增强细胞对葡萄糖的摄取，这一发现为理解其在调节能量代谢中的作用提供了新的视角。

这些研究结果不仅扩展了我们对脂肪组织调控作为抗肥胖和代谢性疾病治疗策略的理解，也为进一步研究提供了重要的实验依据。通过激活**FNDC5/irisin**通路，**SS-IM1**和**hypholomine B**能够影响脂肪细胞的代谢，促进棕色脂肪的形成，并增强产热能力。这些效应与增强的产热能力和减少的脂质积累密切相关，表明它们在调节能量代谢和减少肥胖相关症状方面具有潜在的治疗价值。

此外，我们还探讨了**SS-IM1**和**hypholomine B**在不同模型中的作用机制。通过使用3T3-L1脂肪细胞，我们发现这些成分能够显著促进棕色样脂肪细胞的形成，并改善细胞的能量代谢。这些发现不仅支持了**S. sanghuang**在抗肥胖中的作用，还表明其通过多种途径影响脂肪组织代谢，从而为开发新型抗肥胖药物提供了理论基础。

综上所述，本研究通过系统实验验证了**SS-IM1**和**hypholomine B**在促进棕色脂肪形成和激活中的作用。这些成分能够通过多种机制增强脂肪细胞的代谢功能，包括上调**FNDC5**表达、促进**irisin**分泌、增强线粒体呼吸能力、促进**UCP1**介导的产热以及上调**GLUT4**表达。这些发现不仅为理解**S. sanghuang**的抗肥胖作用提供了新的视角，也为开发针对肥胖和代谢性疾病的新型治疗药物提供了重要的科学依据。