羊膜动物神经元特异性基因在细胞大小多样性背景下的极端进化保守性

《Scientific Reports》：Neuron-specific homologous coding genes and non-coding regulatory regions are the most conserved amongst amniotes despite neuron-specific cell size diversity

　　本研究针对神经元在跨物种间呈现巨大细胞大小多样性却伴随高度序列保守性的矛盾现象，通过分析92种哺乳动物和31种蜥臀类物种的基因组数据，发现神经元特异性同源编码基因及其调控区域在羊膜动物中呈现超乎寻常的进化保守性，其dN/dS比值甚至与ATP酶基因相当。该研究揭示了神经元兴奋性对分子进化施加的强约束，为理解神经元多样性产生的分子机制提供了新视角。

　　

大脑中最为奇特的细胞当属神经元——它们是体内唯一在个体内和跨物种间都表现出巨大尺寸、形态和功能多样性的细胞类型。从小鼠到大象，神经元密度可相差千倍以上，而其他脑细胞如胶质细胞则保持相对稳定的尺寸。这种惊人的多样性似乎与分子进化的一般规律相悖：既往研究表明神经元特异性序列反而比非神经元序列更为保守。这种矛盾引出了一个核心科学问题：神经元巨大的形态多样性是否源于其基因序列的进化可塑性？还是说这种多样性是在基因序列高度保守的背景下通过其他机制产生的？

为了解答这一谜题，范德比尔特大学的Linhe Xu和Suzana Herculano-Houzel团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究。他们收集了涵盖92种哺乳动物和31种蜥臀类物种的基因组数据，系统比较了神经元、胶质细胞和内皮细胞特异性基因的进化保守性。研究团队采用四种不同的细胞特异性基因定义方法以确保结果的可靠性，包括Barres实验室的RNA测序数据、Zeisel等人的单细胞RNA测序数据以及Saunders团队的Drop-seq数据。

研究首先通过计算非同义替换率与同义替换率的比值(dN/dS)来评估蛋白编码序列的进化压力。令人惊讶的是，与预期相反，神经元特异性基因的dN/dS比值显著低于胶质细胞和内皮细胞特异性基因，表明神经元基因受到更强的负选择（净化选择）压力。这种模式在不同哺乳动物类群（灵长类、啮齿类、有袋类等）和蜥臀类中均一致存在。

尤为引人注目的是，近半数的神经元特异性基因的dN/dS比值甚至低于ATP酶和持家基因这些进化保守性的黄金标准。相比之下，小胶质细胞特异性基因的dN/dS比值分布与免疫系统基因相似，反映了其不同的进化轨迹。当与身体其他器官特异性基因比较时，除了心脏和肌肉特异性基因外，神经元特异性基因显示出最强的保守性。

为了探究调控区域的进化模式，研究人员分析了基因上游2000bp启动子区域的phastCons评分（衡量进化保守性的指标）。结果显示神经元特异性基因的启动子区域与胶质细胞相比并无显著差异。然而，当分析通过染色质可及性测定确定的神经元特异性顺式调控元件(cCRE)时，发现神经元cCRE的phastCons评分显著高于非神经元cCRE，表明神经元特异性调控元件同样受到更强的进化约束。

研究人员还排除了基因表达水平对这一结果的潜在影响。通过交叉分析dN/dS比值与基因表达水平（FPKM或UMI计数），发现仅存在极弱的单调关系，且在不同表达水平下，神经元特异性基因始终表现出更低的dN/dS比值。

关键实验技术包括：利用四个独立的细胞特异性基因表达数据集（Barres、Zeisel 2015、Zeisel 2018、Saunders）定义细胞类型特异性基因；基于Ensembl数据库计算92种哺乳动物和31种蜥臀类物种的dN/dS比值；使用UCSC基因组浏览器获取phastCons评分分析启动子和顺式调控元件的进化保守性；通过Gene Ontology富集分析鉴定神经元特异性基因的功能特征；采用单细胞染色质可及性数据（snATAC-seq）识别神经元特异性顺式调控元件。

研究结果

同源神经元特异性编码基因显示极端进化保守性

研究发现，在所有四种数据集中，神经元特异性基因的dN/dS比值分布均显著向更低值偏移，表明其受到最强的负选择压力。这一模式在不同参考基因组（小鼠、人类、大鼠、鸡）和不同物种中均保持一致。值得注意的是，神经元特异性基因的保守程度与ATP酶基因相当，而小胶质细胞特异性基因则与免疫系统基因相似，显示出较高的dN/dS比值。

神经元特异性基因在器官特异性基因中的保守性地位

当与身体其他器官特异性基因比较时，研究发现除了心脏和肌肉特异性基因外，神经元特异性基因显示出最强的进化保守性。肝脏、肺、皮肤、胰腺、肾脏和脑特异性基因（整体）的平均dN/dS比值均显著高于神经元特异性基因。

基因功能特征分析

通过基因本体论(GO)富集分析发现，具有低dN/dS比值的神经元特异性基因显著富集于运输相关和信号转导相关的GO类别，这些类别包括与神经元兴奋性相关的基因，如离子通道和神经递质受体。

调控元件的进化保守性模式

对上游2000bp启动子区域的分析显示，神经元特异性基因的启动子phastCons评分与胶质细胞相比无显著差异。然而，神经元特异性顺式调控元件(cCRE)的phastCons评分显著高于非神经元cCRE，表明神经元特异性调控元件受到更强的进化约束。

表达水平与进化保守性的关系

研究显示，基因表达水平与dN/dS比值之间仅存在极弱的单调关系，且在不同表达水平下，神经元特异性基因均表现出比胶质细胞特异性基因更低的dN/dS比值，表明表达水平不能解释神经元基因的高度保守性。

研究结论与意义

该研究推翻了神经元多样性源于基因序列可变性的传统假设，揭示了神经元特异性编码序列和顺式调控元件在羊膜动物进化中受到极端保守的负选择压力。这种保守性可能源于神经元兴奋性固有的脆弱性——动作电位和膜复极化等电兴奋事件对分子扰动特别敏感，可能导致兴奋性毒性细胞死亡。这种敏感性可能强烈限制了神经元特异性基因功能配置的可能范围。

研究结果表明，神经元巨大的形态和功能多样性是在强序列保守性的背景下产生的，这提示神经元多样性可能通过自我组织机制产生，这些机制建立在基因表达水平的细胞内在变异基础上。这一发现为理解大脑进化提供了新视角，并强调了在分子约束下产生细胞多样性的机制的重要性。

该研究的创新性在于首次在羊膜动物全基因组尺度上系统比较了不同脑细胞类型的进化模式，揭示了神经元特异性基因的极端保守性特征，为理解大脑进化和神经元多样性产生的分子基础提供了重要见解。