基于显微镜的CRISPR筛选平台实现细胞器功能基因组学并揭示纤毛生物学新机制

《Developmental Cell》：A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology

　　本研究针对传统CRISPR筛选技术难以应用于显微镜表征的细胞表型这一技术瓶颈，开发了一种集活细胞成像与固定细胞免疫荧光技术于一体的新型显微镜筛选平台。通过全基因组及靶向筛选，系统鉴定了纤毛发生调控新基因，发现过渡区微蛋白SMIM27/TZMP1在纤毛发生中的关键作用，为细胞器功能基因组学研究提供了强有力的技术支撑。

　　

在细胞生物学研究领域，荧光显微镜技术犹如科学家的"眼睛"，能够直观展现生命活动的精细过程。然而，当研究人员试图将显微镜技术与强大的CRISPR基因编辑技术相结合，进行大规模遗传筛选时，却面临着巨大挑战。传统的CRISPR筛选方法主要依赖于细胞生长或流式分选等宏观指标，难以捕捉显微镜下才能观察到的细微细胞表型变化。这种技术局限严重阻碍了我们对细胞器功能和疾病相关细胞异常的系统性研究。

特别是对于纤毛这种微米级的细胞器，其结构与功能异常会导致一系列纤毛病，包括肥胖、智力障碍、肾脏囊肿和视网膜变性等。尽管已有百余个纤毛病相关基因被鉴定，但我们对纤毛组装、解聚以及信号转导等关键过程的理解仍存在大量空白。开发能够系统分析显微镜表征表型的遗传筛选平台，成为推动这一领域发展的迫切需求。

为了突破这一技术瓶颈，研究团队开发了一套创新的显微镜CRISPR筛选平台，将商业化的显微镜硬件与软件相结合，实现了对活细胞或抗体标记分子的灵活分析。该平台的核心技术方法包括：基于数字微镜器件(DMD)的光活化标记系统、人工智能辅助的图像自动分析算法、适配固定细胞筛选的光活化染料标记策略，以及兼容免疫荧光标记的高通量表型鉴定流程。

研究团队首先建立了稳定表达纤毛标记蛋白HTR6-3xmNeonGreen、中心粒标记miRFP670-Centrin2以及光活化蛋白PA-mCherry的人视网膜色素上皮细胞(RPE1)模型。通过原理验证实验证实，该系统能够有效区分纤毛发生缺陷细胞与正常细胞。初步筛选针对约750个纤毛相关基因，成功鉴定出已知的纤毛发生关键调控因子，如IFT-B复合体亚基和RAB34等，验证了平台可靠性。

全基因组筛选覆盖约2万个基因，鉴定出259个纤毛发生调控关键基因。这些基因显著富集于纤毛和中心体相关功能，且与既往基于Hedgehog信号通量的筛选结果高度吻合。值得注意的是，不同筛选策略揭示了基因功能的特异性：如TULP3缺失仅影响纤毛膜蛋白定位而不影响轴丝结构，而TTLL1/TTLL5则特异性调控微管蛋白多谷氨酰化修饰。

研究进一步发现内质网膜蛋白复合体(EMC)特异性调控纤毛GPCR蛋白HTR6的定位，而不影响纤毛发生本身；m6A甲基转移酶METTL3及其辅助因子VIRMA同样特异性影响HTR6的纤毛定位。此外，筛选鉴定出负向调控纤毛发生的因子DPH1/DPH5，二者通过介导翻译延伸因子eEF2的双酰胺修饰参与纤毛解聚过程。

最为突出的新发现是SMIM27（更名为TZMP1），该基因编码一个55个氨基酸的微蛋白，定位于纤毛过渡区，与MKS模块蛋白相互作用。TZMP1缺失导致纤毛发生严重缺陷，其在哺乳动物细胞和非洲爪蟾胚胎中均表现出保守的生物学功能。在爪蟾模型中，tzmp1基因敲低导致表皮多纤毛细胞运动功能障碍和左右体轴 patterning缺陷，证实其在纤毛相关发育过程中的关键作用。

这项研究成功建立了易实施的显微镜CRISPR筛选平台，突破了传统筛选方法的技术局限。通过多维表型分析，不仅系统描绘了纤毛发生的遗传调控网络，还揭示了过渡区微蛋白TZMP1等新型调控因子。该平台的技术灵活性和可扩展性为细胞器功能基因组学研究提供了新模式，对理解纤毛病发病机制和开发治疗策略具有重要意义。未来，这一技术框架可广泛应用于不同细胞类型和病理模型，推动对亚细胞结构功能的系统性解析。