人源PAN2-PAN3去腺苷化酶复合体调控poly(A)尾长度特异性的分子机制

《Cell Reports》：Mechanisms governing poly(A)-tail-length specificity of the human PAN2-PAN3 deadenylase complex

　　本研究针对哺乳动物mRNA长poly(A)尾（约200–240 nt）与酵母（约90 nt）长度差异的调控机制不明问题，通过合成超长poly(A) RNA（达240 nt）、体外酶活实验及冷冻电镜结构解析，揭示人源PAN2-PAN3通过其PAN3亚基特有的哺乳动物特异性loop区域，形成更长的poly(A)-PABPC1核糖核蛋白（RNP）结合路径，从而偏好长poly(A)尾底物。该研究阐明了去腺苷化酶与poly(A)尾长度协同进化的结构基础，为相关神经发育疾病的分子机制提供新见解。

　　

在真核生物中，mRNA的寿命和翻译效率很大程度上由其3'端的poly(A)尾长度调控。哺乳动物细胞的poly(A)尾平均长度为200–240个腺苷酸（nt），而酵母中仅约90 nt。poly(A)尾并非裸露存在，而是被poly(A)结合蛋白（如人源的PABPC1）完全包裹，形成poly(A)核糖核蛋白（RNP），既能保护mRNA免受非特异性降解，又是去腺苷化酶（如PAN2-PAN3和CCR4-NOT复合体）的作用平台。去腺苷化酶逐步缩短poly(A)尾，最终触发mRNA降解。现有模型认为，PAN2-PAN3负责初始去腺苷化，偏好长poly(A)尾RNP，而CCR4-NOT作用于较短poly(A)尾，但人源与酵母PAN2-PAN3虽高度保守，却呈现截然不同的底物长度偏好性，其分子机制一直未明。

为揭示这一机制，研究人员在《Cell Reports》上发表了最新成果。他们首先开发了一种高效合成超长均聚poly(A) RNA（最长240 nt）的方法，模拟哺乳动物内源poly(A)尾长度。通过体外酶活实验，发现人源PAN2-PAN3对长poly(A)-PABPC1 RNP（如180A）的降解速率显著高于短底物（如90A），重现了其在体内的活性特征。进一步利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了PAN2-PAN3与poly(A)-PABPC1 RNP的复合体结构，发现人源PAN3的伪激酶结构域表面存在三个哺乳动物特异性的带正电荷环状区域（loop1–loop3），这些结构在酵母中缺失，能引导poly(A) RNP沿更长的弯曲路径环绕PAN3二聚体，从而容纳更长的底物。通过交联质谱（XL-MS）和体外pull-down实验验证，loop1突变可显著削弱PAN3与poly(A) RNP的结合，说明这些结构适应是底物长度偏好性的关键。

关键技术方法

研究合成长度精确的poly(A) RNA（最长240 nt），通过体外转录与Cy3标记；利用HEK293细胞表达并纯化人源PAN2-PAN3复合体及PABPC1；采用冷冻电镜解析apo PAN2-PAN3及其与90A_i/180A_i RNP的复合体结构；通过交联质谱（XL-MS）验证蛋白-RNP相互作用；开展体外酶活实验与pull-down分析结合特性。

研究结果

1. 人源PAN2-PAN3去腺苷化酶活性的体外重构

通过优化DNA模板克隆与体外转录策略，成功制备了35 nt序列连接不同长度poly(A)（1–240 nt）的模型RNA，并利用Cy3-UTP标记追踪降解过程。体外实验显示，PAN2-PAN3对180A RNP的降解速率约为90A RNP的两倍，且降解呈逐步模式（每步约27 nt，对应一个PABPC1结合位点），证实其偏好长poly(A)尾的特性可在体外重现。

2. 人源PAN2-PAN3的整体结构

冷冻电镜结构表明，人源PAN2-PAN3整体架构与酵母同源物相似，包含PAN3同二聚体（伪激酶、卷曲螺旋和knob结构域）及PAN2（WD40结构域和UCH-RNase模块）。但人源PAN2的UCH-RNase模块与PAN3核心结合更灵活，且PAN3表面存在哺乳动物特异性loop区域（未在apo结构中观察到有序密度）。

3. poly(A) RNP结合状态下的人源PAN2-PAN3结构

在180A_i RNP（含抑制性3'端GGGAA序列）复合体结构中，poly(A) RNP从PAN2的WD40结构域起始，沿PAN3伪激酶结构域底部弯曲，形成一条延伸至远端伪激酶结构的结合路径，并伴有部分柔性的UCH-RNase模块密度。而90A_i RNP复合体则呈现多种结合状态，其RNP路径较短且方向不固定，说明短底物无法完全覆盖长结合路径，导致结合效率降低。

4. poly(A) RNP的识别机制

结构分析发现，poly(A) RNP与PAN3的结合位点位于伪激酶结构域的大叶loop区域（loop1: 438–445, loop2: 533–556, loop3: 646–655），这些区域富含正电荷和芳香族残基，为哺乳动物特有。XL-MS实验检测到PAN3的Lys⁵⁴²（loop2）与PABPC1的RRM1结构域直接交联，pull-down实验进一步证实loop1突变可几乎完全消除PAN3与90A RNP的结合，说明loop1在底物识别中起核心作用。

结论与意义

本研究阐明了人源PAN2-PAN3通过其PAN3亚基的哺乳动物特异性loop结构，形成更长的poly(A) RNP结合路径，从而适应长poly(A)尾底物的分子机制。当poly(A)尾长度超过150 nt（约结合5个PABPC1）时，可完全覆盖PAN2-PAN3的结合表面，实现高效降解；尾长缩短至110–150 nt以下时，结合稳定性和方向性丧失，底物被移交至CCR4-NOT复合体进行最终降解。该研究不仅揭示了去腺苷化酶与poly(A)尾长度的协同进化规律，还为PAN2突变相关智力发育障碍的病理机制提供了结构见解。