通过多种方法优化的重组蛋白Pichia pastoris-CXCL20a显著抑制了草鱼（Ctenopharyngodon idella）中的GCRV感染

《Aquaculture》：Oral recombinant Pichia pastoris-CXCL20a optimized by combined approaches remarkably inhibits GCRV infection in grass carp (Ctenopharyngodon idella)

　　增强的CXCL20a在毕赤酵母中的表达及对草 carp抗GCRV感染的保护作用。通过密码子优化、多拷贝整合和诱导条件优化，显著提高表达效率。口服300mg/kg Pp-C20a增强草 carp抗氧化能力，上调IL1β、IFN1等免疫基因，抑制病毒复制，提高存活率24%（p<0.05），减轻组织病理损伤。

　　草鱼（*Ctenopharyngodon idella*）作为世界上最重要的淡水养殖鱼类之一，其养殖产业在提供高蛋白食品和促进经济发展方面发挥着关键作用。然而，草鱼出血病（GCHD）的频繁爆发给这一产业带来了严重挑战。该病主要由草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引起，不仅影响草鱼的健康，还导致巨大的经济损失。因此，开发一种绿色、高效且经济的免疫增强策略，以提高草鱼对GCRV的抵抗力，成为当前水产养殖领域的重要研究方向。

抗菌蛋白作为对抗病毒性疾病的一种潜在手段，其应用前景广阔。在本研究中，研究人员利用基因优化、多拷贝整合以及诱导条件优化等策略，成功提升了草鱼趋化因子CXCL20a在*Pichia pastoris*（毕赤酵母）中的细胞内表达效率。选择CXCL20a-b作为主要研究对象，并在三倍拷贝菌株中实现了最佳表达。同时，对诱导参数进行了系统优化，包括96小时的诱导时间、1.0%的甲醇浓度、pH值8.0以及32°C的培养温度。这些优化措施显著提高了蛋白的产量和活性，为后续的免疫评估和疾病防护研究奠定了基础。

在实验过程中，研究人员通过口服给药的方式，评估了不同剂量（100、200或300?mg/kg）的Pp-C20a在草鱼体内的免疫反应和疾病防护效果。结果表明，300?mg/kg剂量的Pp-C20a显著提高了草鱼的存活率，比对照组提高了24%（*p* < 0.05）。此外，Pp-C20a的摄入还提升了草鱼血清中的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和补体C3水平。这些指标的变化表明，Pp-C20a能够有效增强草鱼的抗氧化能力和免疫系统功能。

通过RT-qPCR分析进一步揭示，Pp-C20a的摄入显著上调了多个关键免疫相关基因（如IL1β、IFN1、IFNγ2和IgM）的表达水平，同时抑制了GCRV在头肾、脾脏和肠道中的复制。这些发现表明，Pp-C20a不仅能够激活草鱼的先天免疫反应，还能促进适应性免疫的产生，从而形成多层次的抗病毒防御机制。组织病理学检查也证实，通过饲料补充Pp-C20a可以有效减轻由GCRV感染引起的组织损伤，进一步支持了其在抗病毒保护中的作用。

在研究方法上，研究人员选择了具有“普遍认为是安全”（GRAS）资质的*P. pastoris*作为异源蛋白表达的宿主系统。这一酵母系统在生物制药和工业酶生产中被广泛使用，以其强大的表达和分泌能力著称。与细菌表达系统相比，*P. pastoris*作为真核表达系统，能够提供更准确的后翻译修饰，实现高效的蛋白分泌，并且具备良好的规模化生产能力。此外，已有研究表明，某些抗菌肽在*Escherichia coli*中表达时会因构象错误而失去活性，但在*P. pastoris*中则可以避免这一问题，从而保持其生物活性。这一特性使得*P. pastoris*成为表达抗菌蛋白的理想选择。

值得一提的是，*P. pastoris*能够将完整的抗原递送至无胃和有胃鱼类的肠道中，这为口服给药提供了良好的基础。将蛋白表达在食品级基质中不仅有利于口服传递，还能避免复杂的纯化步骤，从而实现成本效益高的生产方式。此外，已有报道显示，不同蛋白在不同条件下表达的产量差异极大，从最低的0.002?mg/L到最高的831?mg/L。通过优化诱导条件和采用一系列分子策略，如基因优化和多拷贝菌株构建，可以显著提高异源蛋白的产量。

综上所述，本研究通过基因优化、多拷贝整合以及诱导条件优化，成功建立了*P. pastoris* GS115菌株（F3; p3.5k-3CXCL20a-b）用于高效表达CXCL20a。口服补充300?mg/kg的Pp-C20a显著提高了草鱼在GCRV感染后的存活率，并增强了其抗氧化能力和免疫系统功能。这一研究不仅为草鱼养殖中的抗病毒保护提供了可行的策略，也为可持续水产养殖的免疫管理提供了新的思路。

草鱼养殖业的快速发展对食品安全和全球粮食供应具有重要意义。然而，GCRV引起的GCHD仍然是一个难以根除的挑战。传统治疗方法依赖于抗生素和化学药物，这些方法虽然在短期内有效，但长期使用可能导致耐药性问题和环境污染。因此，寻找一种更安全、更环保的免疫增强策略显得尤为重要。抗菌蛋白和趋化因子作为天然免疫调节因子，具有广泛的应用潜力。其中，趋化因子CXCL20a在草鱼中被发现具有显著的抗病毒作用，特别是在GCRV感染后，其表达水平显著上升，并且在草鱼头肾细胞中过表达能够有效抑制病毒复制。

在本研究中，研究人员通过基因优化和多拷贝整合策略，提高了CXCL20a在*P. pastoris*中的表达效率。基因优化是提高异源蛋白表达水平的重要手段之一，通过调整基因序列中的密码子使用频率，可以优化翻译效率和蛋白折叠过程。此外，构建多拷贝菌株可以增加基因拷贝数，从而提高蛋白产量。诱导条件的优化同样不可忽视，通过调整培养时间和诱导剂浓度，可以进一步提高蛋白的表达水平。这些优化措施共同作用，使得Pp-C20a在*P. pastoris*中的表达效率大幅提升。

在实际应用中，研究人员通过口服给药的方式，评估了Pp-C20a在草鱼体内的免疫反应和疾病防护效果。实验结果显示，300?mg/kg剂量的Pp-C20a显著提高了草鱼的存活率，比对照组提高了24%。同时，Pp-C20a的摄入还提升了血清中的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和补体C3水平，表明其能够增强草鱼的抗氧化能力和免疫系统功能。这些结果为Pp-C20a在水产养殖中的应用提供了有力支持。

通过RT-qPCR分析进一步发现，Pp-C20a的摄入显著上调了多个关键免疫相关基因的表达水平，包括IL1β、IFN1、IFNγ2和IgM。这些基因在免疫反应中发挥着重要作用，IL1β是促炎因子，IFN1和IFNγ2则属于干扰素家族，能够增强细胞的抗病毒能力。IgM是免疫球蛋白的一种，主要参与先天免疫反应。这些基因的上调表明，Pp-C20a能够有效激活草鱼的免疫系统，增强其对GCRV的防御能力。同时，Pp-C20a的摄入还显著抑制了GCRV在头肾、脾脏和肠道中的复制，进一步证明了其抗病毒作用。

组织病理学检查结果也支持了这些发现，表明通过饲料补充Pp-C20a可以有效减轻由GCRV感染引起的组织损伤。这些组织损伤通常表现为细胞坏死、炎症反应和器官功能障碍，而Pp-C20a的摄入能够显著缓解这些病理变化，从而提高草鱼的生存能力和健康水平。这一研究不仅揭示了Pp-C20a在抗病毒保护中的作用机制，还为水产养殖业提供了一种新的免疫增强策略。

此外，研究人员还探讨了Pp-C20a在水产养殖中的应用前景。由于*P. pastoris*具有良好的表达和分泌能力，以及其“普遍认为是安全”的特性，Pp-C20a可以通过食品级基质进行口服传递，避免复杂的纯化步骤，从而实现低成本、高效率的生产。这种生产方式不仅符合水产养殖业的实际需求，也为未来开发其他免疫相关蛋白提供了参考。同时，Pp-C20a的表达和分泌能力使其在水产养殖中具有良好的应用前景，有望成为一种新型的生物防治手段。

本研究的成功不仅在于提高了CXCL20a的表达效率，还在于验证了其在草鱼体内的免疫增强效果。通过口服给药的方式，Pp-C20a能够有效激活草鱼的免疫系统，增强其对GCRV的抵抗力。这些结果表明，Pp-C20a不仅可以作为抗病毒治疗的辅助手段，还可能成为一种预防性免疫增强策略。在水产养殖业中，这种策略的应用可以显著减少疾病的发生率，提高草鱼的存活率，从而降低经济损失。

在未来的应用中，研究人员可以进一步优化Pp-C20a的表达和递送方式，以提高其在不同环境条件下的稳定性。此外，还可以探索Pp-C20a与其他免疫相关蛋白的协同作用，以增强其免疫增强效果。这些研究不仅有助于提高草鱼的抗病毒能力，还可能为其他水产养殖动物提供类似的免疫增强策略。同时，Pp-C20a的应用还可以拓展到其他疾病防控领域，为水产养殖业的可持续发展提供更多的技术支持。

综上所述，本研究通过基因优化、多拷贝整合和诱导条件优化，成功构建了一种高效的*P. pastoris*表达系统，用于生产Pp-C20a。通过口服给药的方式，Pp-C20a显著提高了草鱼的免疫反应和疾病防护能力，为水产养殖业提供了一种新的免疫增强策略。这些研究结果不仅具有重要的科学意义，还为水产养殖业的绿色发展提供了新的思路。未来，随着研究的深入和技术的进步，Pp-C20a的应用前景将更加广阔，有望成为水产养殖中不可或缺的免疫增强工具。