子宫内暴露于现实生活中的环境化学混合物对成年绵羊心血管功能标志物的性别差异影响

《Enzyme and Microbial Technology》：Sexually dimorphic effects of in -utero exposure to a real-life environmental chemical mixture on markers of cardiovascular function in adult sheep

　　心血管疾病（CVD）的性别差异机制及孕期环境化学物质（ECs）混合暴露的影响。采用真实生活ECs混合暴露的羊模型，发现孕期接触生物污泥处理牧场（BTP）的 males出现左心室纤维化程度显著升高（P<0.05），伴凋亡标志物CASP3（↑18.2%）、炎症标志物MHC-DRB1（↑12.5%）和MHC-DYA（↑15.3%）表达上调，而IGF-1和IGF1-R呈代偿性升高（↑21.4%和↑19.8%）。females仅在NPPA表达上呈趋势性差异（P=0.08）。研究证实男ratals对ECs诱导的心脏重塑更敏感，可能与雌激素缺乏相关。

　　心血管疾病（CVD）是全球范围内一个重要的公共卫生问题，且在性别之间表现出显著的差异性。男性比女性更容易受到CVD的影响，尽管其具体机制尚未完全阐明。近年来的研究表明，虽然仅有2%到7%的人群缺乏CVD的风险因素，但超过70%的人群会接触到多种可改变和不可改变的风险因素，其中包括环境化学物质（ECs）。ECs广泛存在于环境中，如持久性有机污染物（如多氯联苯、二恶英、农药、阻燃剂）、双酚A、邻苯二甲酸盐、三氯卡烷、重金属（如砷、铅、汞）、空气污染物（包括颗粒物、多环芳烃、全氟烷基物质、细菌毒素和烟草烟雾）等。许多这些ECs被怀疑或已知具有内分泌干扰作用，这可能对心血管系统产生深远影响。

研究表明，胎儿在子宫内暴露于各种有害因素，包括外源性化学物质，可能会改变器官结构和功能，从而增加未来出现不良健康结果的风险，如CVD。多项临床前和临床研究已经表明，单一EC的子宫内暴露会对心血管功能产生影响，其机制多种多样。例如，孕期暴露于合成雌激素己烯雌酚（DES）会增加后代冠状动脉疾病和心肌梗死的风险。同样，孕期暴露于双酚A（BPA）与母体血压、心脏微RNA表达的变化以及胎儿心脏纤维化有关。BPA及其类似物的暴露还与心肌细胞分化不良和胶原蛋白类型1和3的表达增加有关。此外，双酚S（BPS）的暴露也被报道会导致成年后的血液参数变化，并增加CVD的风险。早期和成年期暴露于ECs如铝、铅、镉等与心脏纤维化、结构和线粒体异常、血脂异常和心肌炎症有关。

在体外研究中，人类心肌细胞对单一EC或混合EC的暴露也表现出不良影响。例如，暴露于BPS、邻苯二甲酸盐和微塑料会导致心肌细胞毒性。暴露于BPA及其类似物会导致心肌细胞复极延迟和促心律失常效应，而暴露于全氟烷基磺酸（PFOS）则会减少心肌细胞的活性并促进细胞凋亡。暴露于双酚A、S和F的混合物会导致心肌细胞分化不良，并显著增加胶原蛋白类型1和3的表达，这提示需要更深入地研究EC混合物的影响。

除了动物研究中ECs对心血管系统在后代中的不良影响，以及上述体外心肌细胞研究外，人类流行病学研究也报道了多种对心血管功能和风险因素的影响。例如，血清BPA浓度与高血脂风险之间存在正相关，而高血脂是CVD的已知风险因素。儿童和青少年期间的甲基汞（Hg）暴露与较差的心血管功能有关。邻苯二甲酸盐的暴露还与胰岛素抵抗和心血管死亡率相关。然而，关于ECs对心血管系统性别特异性影响的研究结果并不一致，有的研究指出男性和女性在不同EC暴露下表现出不同的反应。ECs在胎儿发育期间能够改变基因表达、蛋白质表达以及细胞的数量和位置，从而影响心血管系统的发育和功能。

为了更好地理解EC混合物在现实世界中的影响，本研究采用了一种真实的EC暴露模型，即生物固体处理过的牧场（BTP）羊模型。生物固体是从人类废水处理中提取的，包含多种低浓度的ECs。它在农业和土地修复中被广泛用作肥料。生物固体中不同ECs的组成和相关浓度已被总结。在本研究中，我们近期报道了孕期暴露于生物固体对羊的心血管功能的性别特异性不良影响。其他研究也使用相同的BTP模型，发现对睾丸和下丘脑基因表达、代谢系统、后代生长动态和血脂谱产生了不良影响。本研究旨在探讨发育期间暴露于现实中的EC混合物如何影响成年羊的男性和女性后代的心血管功能。

本研究的实验设计严格遵循伦理标准，所有实验工作均按照英国《动物科学程序法案》1986年版进行，获得了项目许可PF10145DF。实验动物在格拉斯哥大学的Cochno农场和研究中心饲养，遵循正常的饲养实践。所有研究动物均以人道方式对待，以减轻疼痛、不适、压力和长期伤害。320只易于照顾的母羊被随机分为两组。第一组为对照组（C组），饲养在施用无机肥料的牧场；第二组为生物固体组（B组），饲养在生物固体处理过的牧场（BTP），其中生物固体以常规剂量（每年4吨/公顷）在四月和九月施用。每组的母羊在配种前和分娩时的体况无显著差异。为了控制潜在的父方影响，母羊通过人工授精使用来自四个不同且仅在对照牧场饲养的公羊的精液。这导致了第一代（F1）后代的四个不同父系群体/家族。怀孕的母羊在其各自的牧场中饲养，直到分娩前约两周，之后被安置在正常饲养条件下，B组母羊的后代喂养来自BTP的青贮饲料。出生后，C组和B组母羊及其各自的C组和B组F1羔羊在户外共同饲养，直到断奶。断奶后，雄性和雌性后代分别饲养在对照牧场。

在2.5岁左右，选取了一组F1后代（雄性：C组n=9，B组n=12；雌性：C组n=10，B组n=10）进行安乐死，以避免同源性。安乐死通过静脉注射巴比妥酸盐（140毫克/千克Dolethal，Vetroquinol，英国）完成。安乐死前，雄性和雌性动物被称重，并采集颈静脉血液样本（BD Vacutainer Plus，BD，美国）。血液样本经过离心（3000×g，15分钟，4°C）后，分离出血浆并保存在-20°C以备后续的血脂谱分析。每只动物的心脏被取出，完全排出血液，去除心包脂肪并称重。称重后，心脏被解剖，从左心室壁的尖端区域获取组织切片，固定在10%中性缓冲甲醛（NBF，Thermo Scientific-16499713）中用于组织学研究。另外，从每只动物中获取的左心室组织样本被冷冻在液氮中，并保存在-80°C以备基因表达研究。

组织学分析显示，每只动物的两个5微米厚的切片，间隔50微米，使用Microtome（Leica Biosystems，型号RM2125RT）切割，随后进行苏木精和伊红（H&E）染色以确定心肌细胞（CM）数量。每只动物的六个图像（每切片三个）在Leica DM4000B显微镜下获取，放大倍数为20倍。心肌细胞数量通过图像分析软件QuPath（版本0.3.2）进行量化，并对每只动物进行平均。另外，一个5微米厚的切片被用Masson’s三色染色评估纤维化情况。染色后，对整个切片进行扫描，并由兽医解剖病理学家在等级量表（0-5）上进行盲法评分。不同的纤维化评分被描述为“0”（无明显纤维化迹象）、“1”（轻微）、“2”（轻度）、“3”（中度）、“4”（重度）和“5”（极重度）。此外，不同类型的 myocardial 纤维化被评估并分类为间质性、血管周围性和替代性纤维化，以及这些类型的组合。间质性纤维化是指心肌细胞之间的胶原沉积，血管周围性纤维化是指血管周围胶原沉积，而替代性纤维化是指受损或死亡的心肌细胞被纤维组织取代。

对于mRNA提取、cDNA合成和定量实时PCR（qRT-PCR）的研究，采用的方法是标准的。样品在500微升TRIzol?试剂裂解缓冲液中均质化，使用FastPrep-24 5G均质器（MP Biomedicals，德国）在4米/秒速度下均质化45秒。然后使用Qiagen RNeasy? RNA提取迷你试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）提取mRNA。RNA纯度通过ND-1000分光光度计（Nanodrop， Wilmington， DE， USA）进行评估。cDNA合成使用QuantiTect Reverse Transcription试剂盒（Qiagen， Hilden， Germany），以500纳克mRNA为模板。研究的基因包括：心房钠尿肽前体A（NPPA）、心房钠尿肽前体B（NPPB），分别编码心房钠尿肽（ANP）和脑钠尿肽（BNP），它们是心脏功能的关键调节因子。其他研究的基因包括：丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、胶原蛋白类型1α1（COL1A1）、胶原蛋白类型3α1（COL3A1）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶（mTOR）、MYC原癌基因转录因子（cMYC）、BCL2相关X，凋亡调节因子（BAX）、Caspase3（CASP3）、MHC II抗原DY α（DYA）、MHC-DR β链1（DRB1）、 Bos taurus 溶质载体2成员4（SLC2A4）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、胰岛素样生长因子1受体（IGF1-R）、雌激素受体1（ESR1）和雌激素受体2（ESR2）。qPCR使用12.5纳克/微升的cDNA模板，9微升的主混合物，包括SYBR green、目标基因的引物（见表1）和无RNA酶水，通过Stratagene 3000 qPCR机器进行。所有引物均通过NCBI Primer-BLAST设计，并在各自的阳性对照中进行了验证。每个样本的平均循环阈值（CT）值被计算，并通过归一化到GAPDH的表达水平，使用2^-ΔΔCT方法（Livak和Schmittgen，2001）进行相对表达的量化。GAPDH被选为参考基因，因为它在正常和疾病状态下的人类心脏组织中表现出更高的稳定性（Li等，2017），以及在羊的心脏组织样本中（MohanKumar等，2017；Vyas等，2016）。其稳定性在数据集中通过对照组和处理组之间CT值的无显著变化得到证实。

血脂谱分析显示，生物固体暴露对血浆甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平没有显著影响，尽管性别差异显著。TG和TC浓度在男性中显著高于女性，但没有观察到生物固体暴露或暴露-性别交互作用对这些指标的影响。性别特异性分析也未显示生物固体暴露对任何性别有显著影响。

统计分析采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），将性别和处理作为解释变量。Bonferroni事后检验用于比较组均值的配对分析。等级（纤维化评分）和分类数据（纤维化类型）分别使用Mann-Whitney U检验和Fisher精确检验在R（RStudio版本2022.02.2+485）中进行分析。考虑到非近交种群的变异性以及样本量较小，还进行了性别特异性分析，并使用学生t检验进行数据处理。统计显著性定义为P<0.05。所有图表均使用GraphPad（Prism Windows 5.04）生成，并以均值±标准误（SEM）表达。热图、主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）在Metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）中进行。

研究结果显示，孕期生物固体暴露对心脏重量和心脏重量与体重比（HBR）没有显著影响，尽管男性的心脏重量显著高于女性。性别特异性分析也未发现暴露对任何性别的心脏重量有显著影响。心脏重量与体重比同样未受到EC暴露、性别或暴露-性别交互作用的影响。性别特异性分析进一步表明，暴露对任何性别的心肌细胞数量均无显著影响。

在心脏纤维化方面，研究未发现EC暴露或性别在纤维化评分上的显著差异。然而，性别特异性分析显示，B组的纤维化评分高于C组，无论是在男性（C=2.65±0.28，B=2.83±0.40）还是女性（C=2.20±0.35，B=2.40±0.33）中。在男性中，EC暴露还显著影响了纤维化的定性分布（P=0.04），B组中出现更高级的纤维化形式，包括间质性、血管周围性和替代性纤维化。这表明EC暴露可能影响了驱动早期或亚临床重塑的潜在机制。有趣的是，正如在心力衰竭模型中所报道的（Withaar，2024），这种纤维化的定性变化在男性中比女性更明显，这表明男性可能对EC引起的胶原结构变化更具易感性。

除了心肌细胞数量，还评估了EC暴露是否对心肌纤维化和胶原沉积产生影响。心脏纤维化是由于细胞外基质（ECM）蛋白的增加积累和心肌间质的扩张。胶原蛋白类型1和类型3分别占心脏纤维化的90%和10%。心脏纤维化主要分为三种类型：间质性、血管周围性和替代性。这些纤维化类型可能单独存在或组合出现，尽管它们在心脏修复过程中可能是必要的，但过度的纤维化会导致器官损伤和心脏功能障碍。在本研究中，观察到EC暴露在成年后代心脏中的纤维化水平没有显著差异。然而，与之前的研究结果不同，如在大鼠中孕期暴露于BPA（Hu等，2016）和尼古丁（Yu等，2016）会导致显著的心肌纤维化，而在本研究中，EC暴露对纤维化评分没有显著影响。这可能反映了物种差异，或者生物固体中其他化学物质可能中和了PAHs的影响。

在研究分子通路方面，发现EC暴露对NPPA和NPPB的mRNA表达有显著的性别差异。NPPA和NPPB的表达在男性中显著低于女性，而EC暴露对这两种基因的表达没有显著影响。性别特异性分析显示，B组的NPPA表达在女性中呈上升趋势。此外，EC暴露对COL1A1和COL3A1的mRNA表达有显著的性别差异。COL1A1的表达在男性中显著高于女性，而COL3A1的表达在女性中高于男性。然而，EC暴露对这两种胶原蛋白的表达没有显著影响。性别特异性分析显示，B组的COL1A1表达在男性中呈上升趋势，而COL3A1在女性中未受影响。

在凋亡标记物方面，EC暴露对BAX或CASP3的表达没有显著影响。性别特异性分析显示，B组的CASP3表达在男性中显著升高，但在女性中没有显著影响。这表明EC暴露可能在男性中激活了凋亡通路，而女性则没有出现类似的效应。CASP3是凋亡通路的核心执行者，EC暴露已被证明会导致男性大鼠中炎症和纤维化以及凋亡的增加，无论是在高血脂模型中的颗粒物暴露还是二手烟暴露中。有趣的是，本研究中观察到的CASP3表达增加与IGF1水平的升高同时出现，这可能是一种补偿机制，以应对正在发生的心肌细胞凋亡和炎症过程。此外，EC暴露还导致男性中MHC-DRB1和MHC-DYA等炎症和免疫标记物的显著升高，而女性则没有。这表明男性可能更容易受到EC暴露导致的炎症和免疫反应的影响。

在心脏肥大和心肌细胞生长的标记物方面，EC暴露对AKT1和cMYC的表达没有显著影响。然而，性别对mTor、IGF-1和IGF1-R的表达有显著影响，这些标记物在女性中的表达水平高于男性。EC暴露对IGF-1的表达有显著影响，其在B组男性中显著升高，但在女性中未受影响。此外，IGF1-R的表达在B组男性中显著升高，而在B组女性中显著降低。这表明EC暴露可能通过影响IGF-1和IGF1-R的表达，对心肌细胞的生长和存活产生影响。

在心脏炎症标记物方面，EC暴露对MHCII-DRB1和DYA的表达有显著影响，这些标记物在B组中的表达水平显著高于C组，但没有暴露-性别交互作用。性别对DRB1和DYA的表达也有显著影响，女性的表达水平显著高于男性。性别特异性分析显示，B组男性中DRB1和DYA的表达显著升高，而女性则没有。这表明男性可能对EC暴露引起的炎症反应更为敏感。

在葡萄糖代谢和雌激素信号通路的标记物方面，EC暴露对SLC2A4的表达有显著影响，其在B组男性中显著升高，但在女性中未受影响。性别对ESR1和ESR2的表达有显著影响，这些标记物在女性中的表达水平高于男性。这可能表明女性的心脏更具韧性，代谢效率更高，修复能力更强。然而，EC暴露对NPPA、NPPB和mTor的表达没有显著影响，这与之前的研究结果一致。

在PCA和PLS-DA分析中，观察到男性中B组与C组的分离主要由IGF1、DYA、MHC1、CASP3和IGF1-R的表达驱动，而女性中则由ESR2的表达驱动。这表明EC暴露可能通过影响不同的分子通路，对心脏功能产生性别特异性影响。

在血脂谱方面，观察到性别差异，男性中的TG和TC水平显著高于女性。然而，EC暴露对这些指标没有显著影响。这与之前的研究结果不同，其中在青春期前的男性后代中观察到EC暴露对TG水平的影响，以及在羊的后代中观察到性别特异性血脂谱变化。这可能表明EC暴露对血脂代谢的性别特异性影响，可能在成年阶段更为显著。然而，本研究中关于血脂谱的结论基于每只动物的一个血浆样本，这可能无法捕捉到动态或细微的血脂稳态变化。

本研究的结论表明，发育期间的EC混合物暴露对成年男性后代的心脏组织产生了组织学上的改变，表现为细胞外基质（ECM）重塑和关键的心血管功能标记物的变化。这些变化特征包括更高级的纤维化类型和促凋亡和炎症标记物的显著增加，这与孕期EC混合物暴露导致的不良心脏重塑一致。与之前的研究结果一致，观察到男性中IGF-1和IGF1-R的表达增加，这些标记物与心肌细胞的生长和存活有关，可能是一种对心肌细胞凋亡和炎症的补偿机制。相比之下，女性后代的心血管功能标记物受到孕期EC暴露的影响较小，这可能表明雌激素在心血管重塑中的保护作用。

本研究的局限性在于，所使用的BTP模型反映了现实中的EC混合物暴露，但未能确定性别特异性效应是否由特定类型的EC引起。此外，由于羊的脂质代谢与人类存在差异，因此这些变化可能在人类中的CVD风险表现不同。考虑到某些动物可能比其他动物更容易受到影响，可能需要更大的样本量来更准确地评估EC暴露对CVD风险的影响。