表皮生长因子受体通过YAP-CCN2依赖性途径促进糖尿病视网膜纤维化

《Experimental Gerontology》：Epidermal growth factor receptor promotes diabetic retinal fibrogenesis via YAP-CCN2-dependent manner

　　糖尿病视网膜纤维化（DR）主要由视网膜血管内皮细胞（RVECs）的EGFR活性诱导视网膜Müller细胞（rMCs）活化及纤维化驱动。研究发现，EGFR抑制剂厄洛替尼可减少糖尿病小鼠视网膜的ECM沉积和纤维化，且糖尿病RVECs conditioned medium可体外激活人Müller细胞系（hMCs），提示旁分泌机制。内皮特异性CCN2基因敲除显著抑制糖尿病小鼠rMC活化及ECM沉积，证实CCN2为EGFR介导的纤维化关键分泌因子。研究还揭示YAP通过调控CCN2在EGFR依赖性信号通路中驱动纤维化，且EGFR通过RhoA/Rock通路调控YAP活性。EGFR-YAP-CCN2信号轴为DR纤维化治疗提供了潜在靶点。

　　糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病患者视力受损的主要原因之一，尤其在2型糖尿病（T2D）和1型糖尿病（T1D）中普遍存在。DR是一种微血管并发症，其病理特征包括视网膜微血管基底膜增厚、细胞外基质（ECM）蛋白的异常沉积以及视网膜纤维化的形成。这些变化最终可能导致视网膜组织的结构破坏和功能障碍，严重时甚至会引发视力丧失。为了深入理解DR的发病机制，科学家们一直在探索哪些分子信号通路在这一过程中发挥关键作用。

本研究关注于表皮生长因子受体（EGFR）在视网膜血管内皮细胞中的活动是否能够激活视网膜 Müller 细胞（rMCs），从而促进糖尿病视网膜纤维化的发生。EGFR 是一种属于 ErbB 家族的受体酪氨酸激酶，当与 HB-EGF、EGF 或 amphiregulin 等配体结合时，EGFR 可以激活其特定的激酶结构域，并进一步磷酸化细胞质尾部中的内源性酪氨酸残基。这种激活过程在多种病理条件下均被观察到，包括糖尿病引起的肾损伤。研究发现，在糖尿病模型中，EGFR 在视网膜血管内皮细胞中表达水平显著升高，并且在糖尿病视网膜病变的进展过程中发挥重要作用。

为了验证 EGFR 在糖尿病视网膜病变中的作用，研究人员使用了 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼（erlotinib）对糖尿病小鼠进行了治疗，并分析了其对 ECM 沉积和视网膜纤维化的影响。结果显示，厄洛替尼的使用显著减少了糖尿病小鼠视网膜中的 ECM 沉积，同时抑制了视网膜纤维化的形成。这表明 EGFR 在糖尿病视网膜病变的纤维化过程中具有促纤维生成的作用。此外，研究人员还通过培养视网膜血管内皮细胞（RVECs）并收集其条件培养基，评估了这些细胞是否能够通过旁分泌机制激活人 Müller 细胞系（hMCs）。实验结果表明，糖尿病 RVECs 的条件培养基确实能够促进 hMCs 的激活，从而进一步推动纤维化过程。

为了进一步探索 EGFR 与视网膜纤维化之间的关系，研究人员还分析了促纤维生成的连接组织生长因子（CCN2）在 EGFR 依赖性纤维化中的作用，以及其对 Yes-相关蛋白（YAP）的调控。CCN2 是一种重要的促纤维生成因子，其在视网膜中的表达水平与纤维化程度密切相关。实验发现，EGFR 的激活能够促进 CCN2 的表达，而 CCN2 又能够进一步激活 YAP。YAP 是 Hippo 信号通路的关键效应分子，它在细胞分化、增殖和凋亡中起着调控作用。当细胞外信号激活 Hippo 通路时，YAP 会被磷酸化并被抑制，从而减少其在细胞核中的活性。然而，在糖尿病视网膜病变中，YAP 的异常激活被观察到，并且其表达水平与视网膜纤维化密切相关。

本研究进一步揭示了 EGFR 与 YAP 之间的调控关系。实验发现，EGFR 的激活能够通过 RhoA/Rock 依赖性通路促进 YAP 的表达，而 YAP 的激活又能够促进 CCN2 的表达，从而形成 EGFR-YAP-CCN2 信号轴。这一信号轴在糖尿病视网膜纤维化的发生过程中起着关键作用。通过基因敲除或药物抑制 YAP，研究人员发现能够显著减少视网膜纤维化并抑制 rMC 的激活。这表明 YAP 在糖尿病视网膜病变的纤维化过程中起着至关重要的作用。

此外，研究还发现，视网膜血管内皮细胞特异性敲除 CCN2 的小鼠在糖尿病模型中表现出显著减少的视网膜纤维化和 ECM 沉积。这进一步支持了 CCN2 在糖尿病视网膜病变中的促纤维生成作用。因此，EGFR-YAP-CCN2 信号轴可能是糖尿病视网膜纤维化的一个关键调控机制。

在糖尿病视网膜病变的病理过程中，rMCs 被激活并转化为具有类似肌成纤维细胞特征的细胞，其表达 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）并促进视网膜上皮/视网膜下膜的收缩。这种转化过程在糖尿病视网膜病变的进展中起着重要作用。然而，目前对于 rMCs 转化和增殖的分子机制仍不完全清楚。本研究通过实验验证了 EGFR 在这一过程中的作用，并揭示了其通过旁分泌机制激活 rMCs 从而促进视网膜纤维化的机制。

在实验设计方面，研究人员首先通过诱导糖尿病模型并使用厄洛替尼进行治疗，观察了 EGFR 活性对视网膜纤维化的影响。实验中使用的糖尿病小鼠模型符合 Helsinki 声明和 ARVO 动物在眼科和视觉研究中的使用指南。实验过程中，研究人员遵循了伦理审查和动物护理的规范，确保实验的科学性和伦理性。糖尿病小鼠的诱导采用链脲佐菌素（STZ）注射的方法，STZ 是一种常用的糖尿病诱导剂，能够特异性地破坏胰岛 β 细胞，从而导致胰岛素分泌减少和血糖水平升高。

在实验观察中，研究人员发现 EGFR 在糖尿病小鼠的视网膜中主要表达于神经节细胞层（GCL），并且与视网膜血管内皮细胞存在密切关联。随着糖尿病模型的建立，视网膜中的 α-SMA 蛋白水平逐渐升高，表明 rMCs 正在被激活并转化为具有纤维生成能力的细胞。为了进一步验证 EGFR 在糖尿病视网膜病变中的作用，研究人员使用了 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼对糖尿病小鼠进行治疗，并观察了其对 ECM 沉积和视网膜纤维化的影响。实验结果显示，厄洛替尼的使用显著减少了糖尿病小鼠视网膜中的 ECM 沉积，并抑制了视网膜纤维化的形成。

此外，研究人员还通过培养视网膜血管内皮细胞并收集其条件培养基，评估了这些细胞是否能够通过旁分泌机制激活人 Müller 细胞系。实验结果表明，糖尿病 RVECs 的条件培养基确实能够促进 hMCs 的激活，从而进一步推动纤维化过程。这表明 EGFR 活性在糖尿病视网膜病变中可能通过旁分泌机制影响 rMCs 的功能。

在探讨 EGFR-YAP-CCN2 信号轴的作用时，研究人员发现 YAP 的激活与 CCN2 的表达密切相关。当 YAP 被激活时，它能够促进 CCN2 的表达，而 CCN2 又能够进一步激活 YAP，形成一个正反馈循环。这种正反馈循环可能在糖尿病视网膜病变的纤维化过程中起着关键作用。通过基因敲除或药物抑制 YAP，研究人员发现能够显著减少视网膜纤维化并抑制 rMCs 的激活，这表明 YAP 在糖尿病视网膜病变的纤维化过程中起着调控作用。

此外，研究人员还发现，EGFR 的激活能够通过 RhoA/Rock 依赖性通路促进 YAP 的表达。RhoA/Rock 通路是一种重要的细胞信号通路，它在细胞迁移、增殖和形态变化中起着重要作用。通过激活 RhoA/Rock 通路，EGFR 能够促进 YAP 的表达，从而进一步推动 CCN2 的表达和视网膜纤维化的形成。这一发现表明，EGFR-YAP-CCN2 信号轴可能在糖尿病视网膜病变的纤维化过程中起着关键作用。

综上所述，本研究揭示了 EGFR 在糖尿病视网膜病变中的促纤维生成作用，并发现 EGFR 活性能够通过旁分泌机制激活 rMCs，从而促进视网膜纤维化的形成。同时，YAP 在这一过程中起着关键的调控作用，其表达水平与 CCN2 的表达水平密切相关。EGFR-YAP-CCN2 信号轴可能成为糖尿病视网膜纤维化的一个重要治疗靶点。通过抑制 EGFR 或 YAP 的活性，可以有效减少视网膜纤维化并改善糖尿病视网膜病变的病理过程。这一研究结果为糖尿病视网膜病变的治疗提供了新的思路和潜在的药物靶点。