人类Schlemm管内皮细胞在循环机械拉伸作用下的表达变化

《Experimental Gerontology》：Expression changes of human Schlemm's canal endothelial cells in response to cyclic mechanical stretch

　　转录组分析揭示Schlemm's canal内皮细胞在机械拉伸下胆固醇代谢及细胞骨架相关基因的调控机制，为青光眼治疗提供新靶点。

　　在眼科疾病研究领域，特别是与青光眼相关的研究中，Schlemm's canal（SC）的内皮细胞（SCECs）在维持眼内压（IOP）稳定方面发挥着关键作用。然而，关于这些细胞如何通过其基因表达调控机制来响应机械应力的具体过程仍不完全清楚。为此，本研究通过分析机械拉伸对SCECs基因表达的影响，探索了这些细胞在生理和病理条件下对IOP变化的适应性机制。

### 1. 研究背景与意义

青光眼是全球范围内导致不可逆失明的主要原因之一，其中以原发性开角型青光眼（POAG）最为常见。尽管青光眼的发病机制复杂，但眼内压升高仍然是唯一可调节的风险因素。因此，调节房水（AH）流出成为疾病管理的核心。在正常情况下，大约90%的房水通过传统的排出途径，即房水小梁网（TM）和Schlemm's canal（SC）排出。SC的内壁内皮细胞（IW）被认为是房水流出阻力的主要来源。在正常眼内压波动下，SCECs能够通过形成微米级的跨细胞孔道来调节房水流动，从而维持IOP的稳定。

当这些细胞受到机械应力影响时，例如由眨眼、眼球运动、眼脉搏或揉眼引起的周期性拉伸，它们会形成特定的孔道，以适应压力变化。近年来，三维连续块面扫描电子显微镜（3D serial block-face scanning electron microscopy）的研究表明，这些孔道主要分为两种类型：一种是穿过细胞体的内孔（I-pores），另一种是相邻内壁细胞之间形成的边界孔（B-pores）。I-pores在房水巨泡的侧面较为常见，其密度在SC的高流量区域更高。这些发现表明，孔道的形成具有空间异质性，并与局部机械力密切相关。

因此，理解SCECs如何通过基因表达变化来适应机械应力，对于揭示青光眼的发病机制以及开发新的治疗方法具有重要意义。本研究首次系统地分析了机械拉伸对SCECs全转录组表达的影响，为后续研究提供了新的视角。

### 2. 研究方法

本研究采用了一种基于RNA测序（RNA-Seq）的方法，以评估机械拉伸对SCECs基因表达的影响。实验中，从三名无眼病史的尸体捐赠者中分离出SCECs，并在无血清的DMEM培养基中进行培养。细胞被固定在BioFlex? 6-Well柔性底部培养板上，并用I型胶原蛋白覆盖。随后，细胞被置于等双轴周期性机械拉伸条件下（15%拉伸，1次/秒），持续24小时，以模拟眼内压波动引起的机械应变。对照组细胞则在相同条件下未接受拉伸处理。

为了确保实验的准确性，所有SCEC样本均为生物学重复，而非技术重复。拉伸后的细胞样本与未拉伸的对照样本分别提取总RNA，并使用mirVana miRNA Isolation Kit进行纯化。RNA的质量和完整性通过Agilent 2100 Bioanalyzer评估，仅选择RNA完整性指数（RIN）≥6的样本进行测序。测序数据通过STAR软件比对至人类参考基因组hg38，并进行基因注释和定量分析。最终，通过DESeq2算法识别出显著差异表达的mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）。

为了进一步验证关键基因的表达变化，研究团队选择了四个基因（DHCR7、PMEPA1、SCD和FIBIN）进行数字滴定PCR（ddPCR）分析。ddPCR能够提供更高的灵敏度和精确度，特别适用于低丰度RNA的检测。所有基因的表达水平均以GAPDH为内参进行标准化，以消除样本间的个体差异。

### 3. 研究结果

通过RNA-Seq分析，研究团队共鉴定了194个差异表达的基因，包括mRNA和lncRNA。这些基因的表达变化显著（P < 0.05，FDR < 0.1），并且其中七个基因曾与青光眼的全基因组关联研究（GWAS）相关。这些基因主要富集在类固醇合成、细胞外基质（ECM）结合以及微管调控等通路中，表明SCECs在机械拉伸下通过这些通路进行复杂的基因调控。

基因功能分析显示，类固醇代谢相关的基因显著上调，包括SCD、DHCR7、FASN、FDPS、LSS、MBTPS1和SREBF2。这些基因的表达变化可能反映了SCECs在机械拉伸下对细胞膜流动性的调节。例如，SCD和DHCR7在房水流出过程中可能起到关键作用，因为它们参与了从饱和脂肪酸到单不饱和脂肪酸的转化，而这一过程对于维持细胞膜的柔韧性至关重要。

此外，研究还发现了一些lncRNA的表达变化，其中七个lncRNA表现出显著的差异表达。这些lncRNA与某些编码基因具有高度的序列相似性，例如CTD-2541J13.2与类肝素硫酸盐表型相关基因（DSEL）的相似性超过85%。DSEL在ECM中起到重要作用，因为它参与了类肝素硫酸盐的合成，这种物质对于维持眼球形状和细胞外基质结构具有重要意义。

### 4. 讨论与分析

#### 4.1 类固醇代谢的调控机制

研究结果表明，SCECs在机械拉伸下显著上调了类固醇合成相关的基因表达。这可能与细胞膜流动性有关，因为类固醇是细胞膜的重要组成部分，能够调节其物理特性。在病理条件下，如青光眼，SCECs的刚性增加可能导致房水流出受阻，从而引起眼内压升高。因此，类固醇代谢的异常可能与青光眼的发生密切相关。

此外，研究还发现了一些与ECM重塑相关的基因，如DSEL和DSE的类似物。这些基因的表达变化可能反映了SCECs对机械拉伸的适应性，例如通过调节ECM的组成来维持细胞结构的稳定性。DSE的突变已被关联到肌腱性埃勒-丹洛综合征（mcEDS），该综合征常伴有眼内压升高和青光眼症状。这进一步支持了SCECs在机械拉伸下通过调节ECM来维持IOP稳定的观点。

#### 4.2 与全基因组关联研究的对比

本研究发现的差异表达基因中有七个与已知的青光眼相关基因位点重叠，包括ANTXR1、MKI67、TMEM119、DDR2、FOSL1、WDR6和FAT4。这些基因主要参与细胞粘附、ECM组织、凋亡和机械信号转导等过程，这些过程对于细胞刚性和细胞骨架的调节至关重要。例如，MKI67和DDR2在细胞周期调控和细胞迁移中发挥重要作用，而FOSL1则与细胞应激反应相关。

这些基因的表达变化可能与青光眼的遗传风险因素有关。例如，一些基因的变异可能影响SCECs对机械应力的响应能力，从而导致房水流出受阻。通过分析这些基因的表达模式，研究团队为理解青光眼的发病机制提供了新的线索。

#### 4.3 与基因表达谱研究的对比

本研究还与之前的一项基因表达谱研究进行了比较。之前的研究显示，CCDC85A和DNAJB4在青光眼患者的SCECs中表达上调，而在本研究中，这些基因的表达变化有所不同。CCDC85A在本研究中表达上调3.36倍，而DNAJB4则在本研究中表达下调1.69倍。这种差异可能与实验条件的不同有关，例如之前的研究使用了全基因组表达谱分析，而本研究采用了全转录组测序技术。

此外，DNAJB4与DNAJB1具有高度的序列相似性，后者编码热休克蛋白40（Hsp40）。Hsp40在细胞应激反应中起到关键作用，能够防止细胞凋亡并维持细胞存活。然而，在本研究中，DNAJB4的表达下降，这可能意味着其在机械拉伸下的功能受到抑制。这种变化可能影响SCECs的应激反应能力，进而影响其在青光眼中的表现。

#### 4.4 研究的局限性与未来方向

尽管本研究提供了重要的发现，但仍存在一些局限性。首先，研究使用的是从尸体捐赠者中分离的SCECs，而不是完整的组织样本。这可能导致细胞在体外培养时的基因表达模式与体内有所不同，因为体外环境缺乏体内复杂的生物信号。其次，实验仅使用了单一拉伸强度（15%）和时间点（24小时），未来的研究需要探索不同拉伸强度和持续时间对基因表达的影响。

此外，由于SCECs的分离和培养过程较为复杂，样本数量有限，这可能影响研究结果的统计效力。未来的研究应扩大样本规模，并包括不同年龄和种族的捐赠者，以提高结果的普遍性。同时，研究团队建议未来可以进一步探索SCECs在不同病理条件下的基因表达变化，例如在青光眼患者中的表现，以更好地理解其在疾病发生中的作用。

### 5. 结论

本研究首次系统地分析了机械拉伸对SCECs全转录组表达的影响，揭示了这些细胞在维持眼内压稳定中的关键作用。研究发现，SCECs通过调节类固醇代谢和细胞骨架的动态变化，来适应机械应力。这些变化可能影响细胞膜的流动性，从而促进房水的排出。

此外，研究还发现了一些与青光眼相关的基因，如DSEL和CCDC85A，这些基因的表达变化可能与细胞的应激反应和ECM重塑有关。通过分析这些基因的功能，研究团队为未来的青光眼治疗提供了潜在的分子靶点。

总之，本研究不仅深化了对SCECs适应机械应力机制的理解，也为青光眼的预防和治疗提供了新的思路。未来的研究应进一步探索这些基因在不同病理条件下的表达变化，并结合其他生物标志物，以更全面地理解青光眼的发病机制。