布罗弗拉尼利德（Broflanilide）通过调节Akt/mTOR和STAT5信号通路，降低乳腺上皮细胞的存活率并抑制乳蛋白的分泌

《Food and Chemical Toxicology》：Broflanilide impairs cell viability and milk protein secretion in mammary epithelial cells by regulating Akt/mTOR and STAT5 signaling

　　溴氟虫腈通过抑制AKT/mTOR信号通路和STAT5核转位，降低乳腺上皮细胞存活率及α-酪蛋白分泌，同时激活NF-κB等炎症通路，从而抑制乳产量。

　　

梁涵 | 安井由纪 | 上原珠美 | 三轮英树 | 小林健

北海道大学农学研究部细胞与组织生物学实验室，日本札幌市060-8589，北9，西9

摘要

布罗氟尼利德（Broflanilide）是一种高效且广泛使用的杀虫剂，它能选择性作用于无脊椎动物的γ-氨基丁酸（GABA）受体。最近的研究表明，该杀虫剂可能对哺乳动物具有毒性。在荷斯坦奶牛的乳脂中检测到了布罗氟尼利德及其代谢物。然而，目前尚不清楚布罗氟尼利德是否会影响乳腺的乳汁分泌。本研究探讨了基于组织残留量的布罗氟尼利德暴露水平对原代乳腺上皮细胞（MECs）存活率和乳汁分泌的影响。实验结果显示，布罗氟尼利德能够调节AKT/mTOR信号通路，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，从而减少MECs的数量。此外，布罗氟尼利德还导致α-酪蛋白和β-酪蛋白的表达异常，并降低了泌乳期MECs向培养基中分泌α-酪蛋白的量，而乳铁蛋白的分泌基本未受影响。布罗氟尼利德显著抑制了STAT5的磷酸化及核内转位，STAT5是调控乳汁生成相关基因表达的关键转录因子。同时，该杀虫剂还抑制了STAT3、p38和JNK的磷酸化，但促进了NF-κB的磷酸化，表明其会干扰炎症相关信号通路。综上所述，即使是在组织残留量水平下，布罗氟尼利德也会通过降低MECs的存活率、抑制乳汁生成相关信号通路以及异常调节炎症反应，从而对哺乳过程产生负面影响。

引言

布罗氟尼利德是一种高效且用途广泛的杀虫剂，被农业生产者和害虫控制人员广泛使用。它通过选择性作用于无脊椎动物的γ-氨基丁酸（GABA）受体来干扰正常的神经传导（Katsuta等人，2019年）。尽管具有这种选择性，但已有研究表明该杀虫剂可能对哺乳动物具有毒性。在小鼠和大鼠中的毒理学研究表明，布罗氟尼利德的主要靶器官是肾上腺、十二指肠和肝脏（Shelat，2020年）。在水生生物（如斑马鱼）中，布罗氟尼利德会引发生殖系统、神经系统和呼吸系统的毒性反应（Patuel等人，2023年；Wang等人，2023年；Wang等人，2025年）。此外，对类似化合物（如氟拉尼林）的致癌性评估显示，它们会增加多种组织中的肿瘤发生风险（Camp，2020年）。这些发现引发了人们对布罗氟尼利德在非目标生物体中安全性的担忧，也凸显了其在不同脊椎动物物种中的潜在生物学影响。

布罗氟尼利德在低剂量下就表现出强烈的杀虫活性，并且其在土壤中的长期残留效果显著。已有报道指出，在农田采集的收获后土壤样本中检测到了布罗氟尼德残留（van Herk等人，2023年）。在25°C的 aerobic 条件下，布罗氟尼德在土壤中的半衰期（DT₅₀）为829至2,220天（Khan，2020年）。该杀虫剂在土壤中的移动性较低，Freundlich 土壤-水分配系数（K_foc）介于3,596至20,204 mL/g之间（Khan，2020年）。布罗氟尼德不仅存在于蔬菜表面，还存在于花椰菜、芥菜和水稻植物的叶片内部，这表明清洗蔬菜无法完全避免摄入该化合物（Fang等人，2023年；Xie等人，2020年；Lin等人，2024年）。此外，残留物研究显示布罗氟尼德及其代谢物可存在于乳脂中。在开始使用含布罗氟尼利德饲料22天后，荷斯坦奶牛的乳汁中检测到了该杀虫剂的残留（日本农业部，2021年）。多种杀虫剂已被证实会对乳腺产生影响，包括引发氧化应激、炎症和细胞死亡（Lee等人，2023年；Sung等人，2023年）。因此，关于布罗氟尼德对牲畜健康和食品安全的影响引发了关注。然而，目前关于该杀虫剂对哺乳生理的影响仍知之甚少。

乳腺上皮细胞（MECs）是构成乳腺泡的唯一细胞类型，负责合成乳汁成分，如酪蛋白、乳铁蛋白、乳脂和乳糖（Svennersten-Sjaunja和Olsson，2005年）。泌乳期MECs的乳汁分泌主要由产后激活的信号转导因子5（STAT5）和糖皮质激素受体（GR）通路驱动（Groner，2002年），这两条通路均能促进乳蛋白基因的转录，有助于维持MECs的乳汁分泌能力。相反，在退化或发炎的乳腺中，乳汁合成会因STAT3和核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活而受到抑制（Sargeant等人，2014年；Jena等人，2019年）。MECs的数量直接影响乳汁产量，并受Akt/mTOR和细胞外信号调节激酶（ERK）等关键细胞存活信号通路的调控（Yu和Cui，2016年；Sun等人，2015年）。这些通路支持细胞增殖、存活和代谢活动，对维持泌乳至关重要。因此，适当激活或抑制这些信号通路对于维持泌乳期乳腺的乳汁分泌至关重要。

在本研究中，我们使用了能够产生主要乳汁成分的原代小鼠MECs培养模型来探讨布罗氟尼德对泌乳期MECs的潜在影响（Kobayashi等人，2016年）。我们还研究了与细胞存活和乳汁分泌相关的信号通路，以确定布罗氟尼德是否通过这些通路影响MECs并破坏乳腺功能。研究结果明确表明，布罗氟尼德能够抑制MECs的增殖和存活，并降低乳汁分泌，同时改变多种信号通路。

实验方法

动物

实验所用小鼠为9周大的雌性ICR小鼠，购自日本SLC公司（静冈）。小鼠在标准条件下饲养（12小时光照/黑暗周期，22–25°C）。通过断头处死小鼠，从第四对乳腺中分离出MECs用于细胞培养。所有实验程序均获得北海道大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号23–0070），并遵循实验室动物护理和使用指南进行。

布罗氟尼利德抑制MECs的细胞增殖并诱导细胞凋亡

为了研究布罗氟尼德对MECs生长的影响，将对数生长期的细胞用不同浓度的布罗氟尼利德处理24小时。0.3 μM的布罗氟尼德处理并未显著影响细胞存活率（图1A）。然而，1 μM的布罗氟尼德处理使细胞增殖率降至对照组的78.42%，更高浓度则导致细胞增殖进一步下降。

为了评估布罗氟尼德对泌乳期MECs的细胞毒性作用，...

讨论

本研究首次揭示了新型杀虫剂布罗氟尼德对MECs的潜在细胞毒性和乳汁分泌抑制作用。我们的发现表明，即使在组织残留量水平下，布罗氟尼德也能抑制MECs的增殖，诱导细胞凋亡，并影响酪蛋白的合成（联合国粮食及农业组织，2022年）。此外，布罗氟尼德还改变了与细胞存活和乳汁分泌相关的信号通路的激活状态。

作者贡献声明

上原珠美：实验设计。梁涵：初稿撰写、实验设计及数据分析。三轮英树：撰写、审稿与编辑、概念构思。小林健：撰写、审稿与编辑、项目管理和资金申请。安井由纪：方法学设计及实验实施

未引用参考文献

联合国粮食及农业组织，2022年；日本农业部，2021年。

数据获取

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了日本学术振兴会（JSP）的科学研究资助（项目编号24K0190304和23K1807003）以及日本科学技术机构（JST SPRING，项目编号JPMJSP2119）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢北海道大学农学研究部动物副产品科学实验室的中村文夫教授在免疫组化和细胞培养技术方面提供的宝贵指导。