RIM1α和RBP凝聚体的液态状态是由脂质维持的

《ACS Nano》：The Liquid State of RIM1α and RBP Condensates is Maintained by Lipids

　　液态-固态相分离、RIM1α/RBP蛋白凝聚体、神经退行性疾病机制、脂质调控、β-折叠纤维、光致发光恢复（FRAP）

　　本文探讨了RIM1α和RBP（RIM-binding protein）在生理条件下的相分离行为及其在液态向固态转变过程中的特性。这些蛋白在突触前膜的活性区中起着关键作用，负责囊泡的定位、准备和融合，而这些过程在神经信号传递中至关重要。研究发现，RIM1α和RBP能够自发形成生物分子凝聚物，并且这些液态凝聚物随着时间推移可能逐渐转变为固态结构。这一转变过程不仅影响了凝聚物的物理性质，还可能与神经退行性疾病中的异常蛋白聚集有关。

### 突触前功能与蛋白聚集的关联

突触是神经系统中传递信息的关键结构，其功能受到突触前和突触后结构的共同影响。突触前的神经递质释放过程依赖于钙离子流入引发的囊泡外排，而这一过程的调控涉及多种蛋白和脂质的相互作用。RIM1α和RBP作为突触前的重要组成部分，不仅在维持神经递质释放的正常运作中起作用，还可能与突触前的异常蛋白聚集相关。蛋白聚集，尤其是形成纤维状结构的聚集，已被发现与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病密切相关。

研究表明，蛋白的相分离现象在细胞中广泛存在，并且能够形成无膜的动态结构。这些液态凝聚物在维持细胞功能方面具有重要作用，但它们的异常行为也可能导致病理性的蛋白聚集。例如，Tau蛋白、α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白、FUS、TDP-43等与神经退行性疾病相关的蛋白都表现出液态相分离的特性，并且在特定条件下可以转变为固态结构。RIM1α和RBP的相分离行为与这些蛋白相似，显示出它们可能在突触前蛋白聚集过程中发挥关键作用。

### RIM1α与RBP的相分离特性

研究通过荧光显微镜和生物物理技术，系统地分析了RIM1α和RBP在不同浓度下的相分离行为。实验结果显示，在0.01到1 μM的RIM1α和0.1到1 μM的RBP浓度范围内，这些蛋白能够形成液态凝聚物。这些凝聚物的形态通常是球形或近似球形，但随着浓度的增加，凝聚物的形态也会发生变化，逐渐形成非球形的结构。在更高浓度下，RIM1α和RBP不仅能够形成液态凝聚物，还可能进一步聚集为固态结构，这种转变被称为液态向固态的过渡。

研究还利用ThT（硫黄素T）荧光检测法来区分液态凝聚物和固态纤维状结构。ThT是一种能够特异性结合β-折叠结构的荧光探针，当其与纤维状蛋白聚集物结合时，会显著增强荧光信号。实验表明，在低浓度下（如0.5 μM RIM1α和0.1 μM RBP），凝聚物表现出较低的ThT活性，表明它们仍处于液态状态。而在高浓度（如1 μM RIM1α和1 μM RBP）下，凝聚物表现出强烈的ThT活性，说明其已经转变为固态结构。这一发现进一步支持了RIM1α和RBP在生理浓度下可能经历液态向固态的转变。

### 液态向固态转变的动态过程

为了进一步研究液态向固态转变的动态过程，研究人员进行了荧光恢复后光漂白（FRAP）实验。FRAP是一种用于评估生物分子动态行为的技术，能够检测分子在凝聚物中的流动性。实验结果表明，新鲜的RIM1α/RBP凝聚物在光漂白后只能部分恢复荧光，说明其内部结构具有一定的限制性。而经过时间老化后的凝聚物则几乎无法恢复荧光，表明其已转变为具有固态特性的结构。这说明，随着时间推移，RIM1α和RBP的凝聚物会经历从液态到固态的转变过程。

此外，研究还通过溶解实验验证了凝聚物的可逆性。在添加相分离抑制剂（如1,6-己二醇）后，新鲜的凝聚物能够迅速溶解，而老化后的凝聚物则表现出更强的稳定性，几乎无法溶解。这一结果表明，液态凝聚物的可逆性随着其成熟而降低，进一步支持了液态向固态转变的观点。研究人员还利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术分析了凝聚物的结构变化。FTIR结果显示，随着时间推移，凝聚物的光谱特征发生了显著变化，表明其从无序的随机卷曲结构转变为具有β-折叠特性的纤维状结构。

### 脂质对相分离过程的影响

除了研究RIM1α和RBP本身的相分离行为，研究还探讨了脂质在这一过程中的作用。脂质是细胞膜的重要组成部分，它们不仅影响膜的物理特性，还可能通过与蛋白质的相互作用调控相分离行为。实验发现，当RIM1α和RBP凝聚物与小单层脂质囊泡（SUVs）共存时，液态向固态的转变被显著抑制。SUVs模拟了突触囊泡的物理特性，如大小、曲率和动态行为，因此被用作研究蛋白质与脂质相互作用的模型系统。

在实验中，研究人员发现SUVs能够包裹RIM1α/RBP凝聚物，使其保持液态状态，并且阻止其进一步形成纤维状结构。这一现象可能与脂质在凝聚物表面的相互作用有关。脂质可能通过减少凝聚物与小分子（如1,6-己二醇）的接触，从而抑制其溶解。此外，某些脂质成分（如胆固醇）可能通过增强凝聚物与脂质膜的结合能力，进一步稳定其液态状态。这些结果表明，脂质在调控RIM1α和RBP的相分离行为中起到了重要作用，尤其是在维持其功能性液态状态方面。

### 脂质对纤维形成的影响

为了进一步探究脂质对纤维形成的影响，研究人员利用透射电子显微镜（TEM）对经过23天培养的RIM1α/RBP凝聚物进行了形态学分析。TEM结果显示，这些凝聚物形成了具有纤维状结构的长条形聚集体，其长度可达1微米，宽度则在纳米尺度范围内。这种纤维状结构与许多神经退行性疾病中观察到的异常蛋白聚集相似，表明RIM1α和RBP的相分离行为可能与这些疾病的发生机制相关。

研究还发现，脂质囊泡不仅能够抑制液态向固态的转变，还可能阻止纤维的形成。当SUVs被添加到RIM1α/RBP凝聚物中时，凝聚物保持了其液态特性，并且没有形成纤维状结构。这一结果表明，脂质在维持凝聚物的液态状态方面具有关键作用，可能通过物理屏障的方式阻止纤维的形成。此外，脂质还可能通过改变凝聚物的表面性质，干扰纤维形成的初始步骤，从而抑制异常蛋白聚集的发生。

### 研究意义与未来方向

本文的研究揭示了RIM1α和RBP在突触前功能中的双重作用。一方面，它们通过液态相分离的方式组织突触前结构，帮助神经递质的释放；另一方面，它们在特定条件下也可能经历液态向固态的转变，导致异常蛋白聚集，这可能与神经退行性疾病的病理机制相关。研究还表明，脂质在这一过程中起到了重要的调控作用，通过稳定凝聚物的液态状态，抑制其进一步聚集为纤维状结构。

这些发现不仅加深了我们对突触前蛋白功能和异常聚集机制的理解，还为研究神经退行性疾病提供了新的视角。例如，脂质在维持生物分子凝聚物的液态状态方面的作用，可能为开发新的治疗策略提供了思路。通过调控脂质的组成或引入特定的脂质成分，或许可以有效防止异常蛋白聚集的发生，从而延缓或阻止神经退行性疾病的发展。

此外，本文的研究方法为理解生物分子相分离的机制提供了重要的实验依据。结合荧光显微镜、生物物理技术、FTIR光谱和TEM等多手段，研究人员能够全面分析RIM1α和RBP的相分离行为及其动态变化。这些技术的应用不仅限于RIM1α和RBP，还可以推广到其他与神经退行性疾病相关的蛋白，帮助我们更深入地理解这些蛋白在细胞内的行为及其与疾病的关系。

总之，本文的研究为突触前蛋白的功能和异常聚集机制提供了新的证据，并揭示了脂质在调控这些过程中的关键作用。这些发现不仅有助于我们理解神经系统的正常运作，还可能为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。未来的研究可以进一步探讨脂质如何具体影响蛋白的相分离行为，以及这种影响是否可以被调控，从而为开发新的药物或治疗手段提供理论基础。