对纽约州产生神经毒素的梭菌属物种进行全基因组测序，以加强流行病学研究，并揭示其多样性和分布模式

《Frontiers in Public Health》：Whole genome sequencing of neurotoxin-producing Clostridium species in New York state to bolster epidemiological investigations and reveal patterns of diversity and distribution

　　梭菌属产神经毒素菌株的基因组分析及其在流行病学中的应用。通过全基因组测序（WGS）对240余株梭菌分离株进行单核苷酸多态性（SNP）分析、系统发育重建和毒素亚型检测，发现7种罕见毒素血清型/组合（如A4/B5、A5/B2'、B5F2），验证了传统检测方法的局限性。研究揭示了环境样本与临床标本的遗传关联性，并证实了水平基因转移对基因组多样性影响显著。然而，SNP阈值设定、长读长测序技术整合及标准化分析流程仍是主要挑战。

　　在人类和动物健康领域，一些细菌被公认为具有重要的公共卫生意义。其中，*Clostridia*（梭菌属）特别是那些能够产生神经毒素的菌株，因其与肉毒中毒（botulism）的关联而备受关注。肉毒中毒是一种罕见但严重的疾病，其特征是神经系统功能的急性、对称性、下行性瘫痪。虽然该病的发病率较低，但其临床严重程度和潜在的致命性使其成为公共卫生监测和研究的重点。为了有效识别和控制肉毒中毒的爆发，实验室研究和流行病学调查显得尤为重要。

在传统方法中，检测肉毒中毒通常依赖于培养法、分子方法如聚合酶链式反应（PCR）以及动物生物测定法（mouse bioassay）和内肽酶-质谱分析（Endopep-MS）。这些方法虽然在某些情况下有效，但在精确区分相关菌株、确认毒素活性以及追踪爆发源方面存在局限性。近年来，随着新一代测序（NGS）技术的发展，全基因组测序（WGS）被引入以提供更高的分辨率和更全面的分析。WGS不仅可以用于基因组比较，还能支持单核苷酸多态性（SNP）分析、毒素除了分类和结构分析，从而为流行病学调查提供更精确的数据支持。

本文讨论了纽约州卫生部（NYSDOH）瓦德斯沃斯中心生物防御实验室的一项研究，他们对过去40年中收集的约240个*Clostridium* spp.（梭菌属）菌株进行了全基因组测序分析。这些菌株包括来自临床、动物、环境等不同来源的样本。通过WGS，研究人员发现了多种罕见的肉毒毒素亚型，例如A4(B5)、A5(B2’)和B5F2等，这些亚型在常规检测中较少被观察到。此外，SNP分析还帮助验证了某些流行病学联系，或区分了此前仅通过传统方法检测的样本。这一研究结果不仅揭示了梭菌属菌株的遗传多样性，也为未来追踪爆发源和理解其全球传播模式提供了重要信息。

在具体研究方法上，实验室采用了多种技术来确保样本的准确处理和分析。首先，样本经过初步筛查，包括实时PCR（rtPCR）和Endopep-MS检测，以快速识别阳性样本。随后，通过培养和分离技术获得纯培养物，以便进一步的基因组分析。对于临床样本，由于肉毒中毒患者往往存在肠道运动减弱的情况，样本处理时需特别注意避免过度稀释，以免影响毒素或DNA的检测。对于土壤、蜂蜜等环境样本，采用不同的处理方式以提高检测的敏感性和准确性。在DNA提取过程中，实验室采用了改良的Epicentre MasterPure Complete方法，以确保高质量的基因组数据。此外，为了提高测序效率，研究人员将多个阳性样本分组进行测序，以降低整体成本。

在测序和分析阶段，研究人员使用了Illumina平台，目标是每个菌株获得约100倍的基因组覆盖。测序数据经过过滤和修剪，以去除低质量的读段，并通过比对到参考基因组进行SNP检测。为提高分析的准确性，实验室还使用了多种工具，包括BWA-MEM、Picard、SAMTools/BCFtools、snp-sites和snp-dists等，对SNP进行筛选和分析。同时，为了进一步确认毒素除了类型，实验室还进行了*de novo*基因组组装和注释，使用工具如Shovill、Bakta、Busco、Quast和MOB-suite等，以确保基因组的完整性和可靠性。此外，通过BLASTN和MAFFT等工具，研究人员能够识别和比对* bont*基因，并构建基因家族树，以验证毒素除了分类的准确性。

在研究结果中，实验室发现不同毒素除了类型的菌株在基因组上表现出显著的多样性。例如，在一个与家庭自制豆类食品相关的病例中，*Clostridium parabotulinum* A1(B5)菌株从不同患者的粪便样本、沙拉碗和空罐头中分离出来，且这些菌株在基因组上几乎完全一致，进一步支持了流行病学上的关联。然而，在另一例与蜂蜜相关的病例中，虽然毒素除了类型被鉴定为A5(B2’)和B2，但rtPCR和Endopep-MS检测却仅显示A型毒素活性，这可能是因为B2基因存在较大的缺失，导致传统方法无法检测到其活性。这一发现强调了NGS在解析复杂毒素除了表达和基因变异方面的优势。

此外，研究还发现一些菌株在基因组上表现出不同的毒素除了分布模式。例如，*Clostridium sporogenes*（梭状芽孢杆菌）的毒素除了B1基因在多个菌株中被检测到，而这些菌株在基因组上形成了一个高度保守的簇。这表明，某些毒素除了可能在不同的基因组背景下广泛存在，并且其传播可能受到水平基因转移和重组的影响。同样，*Clostridium botulinum*（肉毒梭菌）的毒素除了E8在多个地理区域的样本中被发现，且这些菌株之间的基因组差异较小，这可能意味着它们来自稳定的环境库，如湖泊或湿地。然而，一些菌株在毒素除了类型和基因组结构上表现出显著的差异，这可能与宿主特异性、环境适应性或基因重组有关。

在分析过程中，研究人员还发现了一些重要的问题。例如，虽然SNP分析能够有效区分相关菌株，但缺乏统一的SNP阈值标准，这可能影响流行病学联系的判断。此外，*de novo*基因组组装在某些情况下未能检测到毒素除了基因，这可能与基因组不完整、毒素基因位于质粒上或质粒在培养过程中丢失有关。相比之下，基于参考基因组的比对方法在检测毒素除了基因和亚型方面表现出更高的敏感性。因此，实验室建议在未来的分析中，应结合不同的测序方法，以提高检测的全面性和准确性。

本研究还探讨了将WGS纳入公共卫生实验室工作流程的潜力。通过WGS，研究人员能够更精确地分类和分析肉毒毒素生产菌株，从而提高流行病学调查的效率和可靠性。然而，实施WGS仍然面临一些挑战，包括对生物信息学分析的专业知识需求、缺乏标准化的分析流程以及确定合适的SNP阈值以区分相关样本。为了解决这些问题，实验室建议采用长读长测序（LRS）技术，以提高基因组组装的准确性，特别是对于重复区域和质粒的分析。此外，结合靶向富集或捕获技术，可以进一步提高对原始样本中低丰度毒素除了基因的检测能力。

在结论部分，研究人员强调了WGS在公共卫生领域的应用前景。通过扩展现有数据集，WGS能够为未来流行病学调查提供重要的参考基因组和背景信息，从而更好地理解梭菌属的进化、多样性和全球分布模式。然而，目前的样本收集范围有限，尤其是缺乏中南部地区的数据，这可能影响对区域传播模式的全面分析。因此，实验室呼吁加强主动监测，包括家庭和环境样本的采集，以更全面地识别潜在的污染源。此外，建立一个全国或国际的数据库，并制定标准化的分析流程，对于提高肉毒毒素检测的准确性和效率至关重要。

总体而言，本研究通过WGS技术对梭菌属菌株进行了深入分析，揭示了其在毒素除了类型、基因分布和传播模式上的多样性。同时，研究也指出了当前NGS技术在实际应用中的一些局限性，并提出了可能的解决方案，如使用LRS技术、改进样本处理流程和建立标准化分析体系。这些发现不仅有助于改善肉毒中毒的诊断和流行病学追踪，也为未来的研究提供了重要的数据支持和方法论指导。