利用锑特异性外排系统（ant操纵子）改造ArsR细菌砷传感器以解决锑交叉反应性

《Microbial Cell Factories》：Repurposing the Sb(III)-specific efflux and sequestration system (ant operon) to mitigate antimonite cross-talk in ArsR-based bacterial arsenite sensors

　　本研究针对ArsR细菌全细胞传感器对As(III)/Sb(III)存在交叉反应性的技术瓶颈，通过将来自Comamonas testosteroni JL40的Sb(III)特异性外排和螯合系统（ant操纵子）引入基于脱氧紫色素（DV）报告系统的砷传感底盘，成功构建了高选择性As(III)传感器TOP10/pJ23119-antACR1。该传感器将Sb(III)检测限从0.073μM提升至0.586μM，同时保持对As(III)的纳摩尔级灵敏度（LOD=18 nM），并在90%淡水和50%海水基质中实现0-2.5μM As(III)的准确定量，为复杂环境水体中砷污染监测提供了低成本、便携式解决方案。

　　

砷是地壳中含量第20位的类金属，通过地质过程和人类活动进入水圈。在水生环境中，无机砷主要以亚砷酸盐[As(III)]和砷酸盐[As(V)]形式存在，其中As(III)具有更高的迁移性、生物利用度和毒性。长期暴露于低浓度As(III)与皮肤病变、心血管疾病和多种癌症相关，因此世界卫生组织将饮用水砷限值设定为10μg/L。

尽管仪器分析技术是砷检测的金标准，但其设备昂贵、操作复杂且需要实验室环境。全细胞生物传感器作为一种新兴替代方法，通过将传感模块（通常为ArsR阻遏蛋白及其操纵子）与报告模块（荧光蛋白、荧光素酶或色素酶）在活细菌中进行遗传耦合，实现了快速、无需试剂且可现场部署的检测。然而，基于ArsR的传感器对第15族类金属（尤其是锑[Sb(III)]）存在广泛交叉反应性，这严重限制了其在复杂环境样品中的特异性应用。

近期研究发现，来自Comamonas testosteroni JL40的ant操纵子可通过外排ATP酶AntA、金属伴侣蛋白AntC和调节因子AntR confer Sb(III)特异性抗性。本研究创新性地将这一Sb(III)特异性抗性系统作为"遗传防火墙"引入ArsR-DV生物传感器底盘，通过选择性消耗细胞内Sb(III)而不影响As(III)敏感性，成功解决了长期困扰砷生物传感器的交叉反应性问题。

研究人员采用的关键技术方法包括：构建基于E. coli K12 ars操纵子的脱氧紫色素报告系统pJ23119-K12；通过分子克隆将antA、antC和不同antR同源基因在组成型启动子（PceuR或PJ23119）控制下引入传感器底盘；系统评估工程化传感器对As(III)和Sb(III)的剂量反应曲线、检测限和线性范围；通过金属选择性实验验证传感器对二价金属离子和Sb(III)的特异性；在90%淡水和50%海水等环境水体基质中验证传感器性能，并与原子荧光光谱法进行对比验证。

Engineering the Sb(III)-responsive ant Operon to enhance As(III) selectivity of ArsR-based biosensors

研究人员首先构建了基础传感器pJ23119-K12，该质粒包含来自E. coli K12染色体ars操纵子的砷感应模块，其中天然抗性基因被截短的紫色素生物合成操纵子vioABCE取代。在无砷条件下，二聚体ArsR与Pars启动子内的ArsR结合位点（ABS）结合，抑制vioABCE转录；当细胞内积累As(III)或Sb(III)时，ArsR发生构象变化，从ABS解离，触发DV合成。然而，该传感器对第15族类金属缺乏选择性，尤其对Sb(III)存在明显交叉反应。

为减弱Sb(III)介导的假阳性，研究团队系统性地将ant操纵子组件（单独或组合）引入ArsR传感底盘。分别构建了pJ23119-antA、pJ23119-antC、pJ23119-antAC等衍生物质粒，并通过将PceuR启动子替换为强启动子PJ23119构建了pJ23119-HAntAC，最后通过共表达AntR同源基因（AntR1、AntR2和AntR3）构建了pJ23119-antACR1/2/3。

Impact of individual or combined AntA and AntC expression on biosensor performance

所有工程化菌株均保持了稳健的As(III)响应性，呈现典型的S形剂量反应曲线。引入antA或antC（单独或组合）后，As(III)的检测限略微增加至0.018μM，定量范围变窄。然而，AntA和AntC显著改变了Sb(III)响应：单基因构建体将Sb(III)检测限从亲本传感器的0.146μM略微提高至0.293μM，而AntAC共表达菌株将Sb(III)检测限提高四倍至0.586μM，并显著抑制色素积累。当使用强启动子PJ23119过表达AntAC时，Sb(III)响应进一步降低，但As(III)检测限显著增加至0.293μM，表明需要在Sb(III)抗性和As(III)敏感性之间取得平衡。

Synergistic impact of AntA, AntC, and AntR on As(III) signaling

所有表达AntR的衍生物均保持了典型的钟形As(III)剂量反应曲线。与亲本菌株TOP10/pJ23119-antAC相比，TOP10/pJ23119-antACR1和TOP10/pJ23119-antACR2产生明显更强的DV信号，其中antACR1显示最显著的放大效果。引入AntR1 sequestration模块将峰值响应移至37.5μM，并将线性范围扩展至36nM-37.5μM（R²=0.991），而As(III)检测限保持不变。尽管AntR同源基因旨在仅螯合Sb(III)，但它们的细胞内积累意外地放大了As(III)信号传导，拓宽了动态范围，表明AntR可能通过操作子序列重叠或与启动子区域共结合直接或间接调节ArsR-Pars调控回路。

Selectivity and interference resistance of TOP10/pJ23119-antACR1

优化后的生物传感器TOP10/pJ23119-antACR1对二价金属离子（Cd、Pb、Cu、Hg、Mn、Mg）无响应，仅对As(III)产生显著DV信号。Sb(III)在1.2和2.4μM时诱导轻微但统计显著的色素增加，但颜色在视觉上仍保持微弱。在0.15μM As(III)与0.5或1μM每种干扰金属共暴露条件下，细菌生长和As(III)依赖性DV产生均未受影响，即使1μM Sb(III)（远高于环境水平）也不影响As(III)检测。

Environmental validation of TOP10/pJ23119-antACR1

在90%淡水和50%海水配方中，TOP10/pJ23119-antACR1在所有基质中均保持稳定的细胞密度和清晰的As(III)剂量反应关系。表面水中的高溶解性有机碳和海水盐度均未损害信号传导，所有基质在0-2.5μM As(III)范围内均显示强线性相关（R²>0.99）。通过对自来水、地表水和海水样品加标检测（0.2和0.6μM As(III)），生物传感器检测结果与原子荧光光谱法高度一致，验证了其在实际环境样品中的准确性和可靠性。

本研究通过将Sb(III)特异性ant抗性模块与ArsR-based脱氧紫色素报告底盘相结合，成功开发了一种选择性As(III)全细胞生物传感器。AntA P型ATP酶和金属伴侣蛋白AntC的共表达将Sb(III)检测限降低四倍，而金属调节因子AntR1的引入意外放大了As(III)信号并拓宽了线性范围。最终传感器TOP10/pJ23119-antACR1能够区分As(III)与各种二价重金属，耐受高达1μM Sb(III)而不损失准确性，并在90%淡水和50%海水基质中实现准确定量。这种ant-ars交叉操纵子组装方法为增强对As(III)相对于其他第15族类金属（如Sb(III)）的选择性提供了一种有前景的策略，突出了TOP10/pJ23119-antACR1作为环境砷监测低成本、高通量工具的潜力。不同金属抗性系统之间的交叉调控为开发具有卓越As(III)选择性和更广环境相关性的下一代第15族类金属传感器指明了新方向。