利用rx3基因座Gal4插入实现斑马鱼眼区命运细胞的可视化与操作新工具

《Biological Research》：A gal4 insertion in the rx3 locus as a tool for visualization and manipulation of eye fated cells in zebrafish

　　本研究针对斑马鱼眼发育关键转录因子rx3缺乏高保真报告工具的问题，开发了新型基因捕获品系tg(gSAIzGFFD2459B)。研究人员通过Gal4/UAS系统实现了眼区命运细胞的精准标记，发现该品系在杂合状态下可忠实再现内源性rx3表达模式，纯合时则呈现完全外显的无眼表型。该工具为研究眼脑发育机制及先天性眼病模型提供了重要平台。

　　

在脊椎动物胚胎发育的奇妙旅程中，眼睛的形成堪称一场精妙的细胞交响乐。斑马鱼因其胚胎透明、发育迅速等特点，成为研究这一过程的理想模型。在眼发育的早期阶段，位于前神经板的眼区命运细胞开始表达一系列保守的转录因子，其中视网膜同源框基因3（rx3）是最早出现且至关重要的标志物之一。rx3不仅标志着眼区的特化，更在后续的眼泡外突、视泡形成等关键形态发生事件中扮演着核心角色。然而，尽管rx3的重要性已被广泛认可，科学界长期以来缺乏能够高保真再现其内源性表达模式的遗传工具。现有的转基因报告品系多采用异源（如青鳉）调控序列驱动，往往出现不在正常rx3表达区域的异位表达，这在一定程度上限制了对rx3功能及其调控机制的精准解析。

为了解决这一技术瓶颈，发表在《Biological Research》上的这项研究，开发并鉴定了一种名为tg(gSAIzGFFD2459B)的新型基因捕获斑马鱼品系。该品系的独特之处在于，其将一个Gal4转录激活因子精准地插入到rx3基因的第二外显子中。这使得该品系兼具双重功能：在杂合子状态下，它能够作为rx3表达的高保真报告基因；而在纯合子状态下，则由于基因功能的丧失，呈现出显著的眼发育缺陷表型，从而成为一个功能缺失模型。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术：首先，通过对大规模基因/增强子捕获品系库（zTRAP数据库）进行筛选，初步锁定了在眼中具有特异性表达的报告品系；其次，利用基因分型PCR（聚合酶链式反应）和测序技术，精确确定了转基因在rx3基因座中的插入位点；再者，通过整体原位杂交技术，将转基因驱动的报告基因表达模式与内源性rx3的mRNA表达模式进行了比对验证；此外，还利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜/光片显微镜成像技术，对报告基因的表达进行了高分辨率的时空动态分析；最后，通过将新品系与不同的UAS（上游激活序列）报告品系（如tg(UAS:GFP)^{绿色荧光蛋白}和tg(UAS:RFP)^{红色荧光蛋白}）进行杂交，验证了Gal4/UAS系统的模块化功能和表达特异性。

tg(gSAIzGFFD2459B)驱动基因在斑马鱼眼和脑细胞中的表达

研究人员首先详细描绘了tg(gSAIzGFFD2459B; UAS:GFP)品系在杂合子胚胎中的表达模式。结果发现，报告基因GFP的表达始于胚胎发育早期（约11小时受精后，2-3体节期），特异性出现在前神经板的眼区中。随着发育的进行，这些GFP阳性的细胞发生外突，向两侧迁移形成视泡，进而折叠成视杯。在24小时受精后，GFP表达持续存在于视杯的视网膜前体细胞中。至33小时和48小时受精后，表达区域除了视网膜，还扩展至下丘脑。到了72小时受精后，当视网膜细胞已基本分化并形成层次结构时，GFP表达仍广泛存在于中枢视网膜和下丘脑区域。这一动态表达谱与已知的rx3在内眼发育和特定脑区（如下丘脑）中的表达模式高度吻合。

tg(gSAIzGFFD2459B)是rx3基因座中的一个基因捕获插入

为了确认驱动上述特异性表达的基因，研究人员通过生物信息学分析和实验验证，确定转基因确实插入在rx3基因的第二外显子内，距离该外显子起始位置58个碱基对下游。基因分型PCR和测序结果均证实了这一插入位点。此外，通过整体原位杂交比较发现，转基因驱动的GFP表达模式与内源性rx3 mRNA的表达模式在眼区、视泡和下丘脑等关键区域高度一致，从而强有力地证明该品系能够忠实报告内源性rx3的表达。

tg(gSAIzGFFD2459B)作为比现有转基因品系更忠实的rx3表达报告基因

研究团队将新开发的tg(gSAIzGFFD2459B)品系与一个已发表的、使用青鳉rx3调控序列驱动的报告品系tg(rx3:Gal4-VP16; UAS:RFP)进行了直接比较。结果显示，旧品系虽然在眼中表达了RFP，但在脑部和脊索等rx3本不表达的区域出现了明显的异位表达。相比之下，tg(gSAIzGFFD2459B)品系的GFP表达则严格限制在rx3的正常表达域内，没有任何可检测到的异位表达。这表明，利用斑马鱼自身rx3基因座的天然调控环境，能够获得比使用异源调控序列更精确、更生理相关的报告效果。

纯合tg(gSAIzGFFD2459B)插入导致无眼表型

当研究人员将杂合的tg(gSAIzGFFD2459B)品系进行自交后，获得了纯合子胚胎。这些纯合子胚胎表现出完全外显的无眼表型，即眼睛结构完全缺失。进一步的观察发现，在发育早期（11小时受精后），纯合子与杂合子一样，在眼区有GFP阳性细胞。然而，到了24小时受精后，这些本该向外侧迁移形成视泡的细胞却未能正常迁移，而是滞留在了前脑区域。这种细胞迁移的失败直接导致了后续眼睛结构无法形成。这一表型与rx3基因功能完全丧失的预期结果一致，并且比一些已报道的rx3突变体（其突变位点位于同源域内或之后，可能产生部分功能残留）的表型更为严重，提示该Gal4插入可能创造了一个真正的功能无效（null）等位基因。

Tg(gSAIzGFFD2459B)可与现有的UAS转基因工具结合使用

为了展示该品系的实用性和灵活性，研究人员将其与tg(UAS:RFP)报告品系杂交。结果发现，RFP报告基因的表达模式与GFP报告基因的表达模式完全相同，均精准地标记了rx3的表达区域。这证明了tg(gSAIzGFFD2459B)品系能够与不同的UAS效应器模块兼容，为后续的功能研究（如细胞谱系追踪、特定细胞群消融、基因功能操控等）提供了极大的便利。

综上所述，本研究成功构建并系统鉴定了斑马鱼rx3基因Gal4基因捕获品系tg(gSAIzGFFD2459B)。该品系的核心优势在于其双重功能和高保真性：作为报告工具，它能够精确、稳定地标记rx3阳性的眼区命运细胞及其衍生细胞，且无ectopic expression（异位表达），为实时观察眼和脑相关区域的发育过程提供了强大工具；作为功能缺失模型，其纯合子产生的完全无眼表型，不仅再次证实了rx3在眼泡外突和眼形成中的决定性作用，也为研究先天性无眼症等发育障碍提供了有价值的模型。该工具的模块化设计（兼容各类UAS效应器）使其成为一个可调谐的研究平台，有望在未来的研究中广泛应用于眼发育、神经发生、脑组织形成等领域的细胞谱系追踪、基因功能操控和疾病建模，从而深化我们对脊椎动物器官发生遗传基础及相关人类先天性疾病的理解。