结直肠癌胆固醇代谢亚型多组学分析揭示肿瘤微环境异质性及预后新机制

《Hormones & Cancer》：Multi-omics analysis reveals different cholesterol metabolism subtypes in colorectal cancer

　　本研究针对结直肠癌胆固醇代谢异质性机制不清的问题，通过多组学分析鉴定出两种胆固醇代谢亚型：A亚型（酯化/储存型）与不良预后、免疫抑制微环境相关，B亚型（分解代谢型）则呈现活跃免疫状态。研究构建了CM相关预后标志物（CMRPS），为CRC分层治疗提供新视角。

　　

在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的发病率和死亡率分别位居第三和第二位，近年来随着生活方式的改变，中国的结直肠癌发病率和死亡率也呈现上升趋势，给医疗卫生系统带来了沉重负担。尽管手术、化疗、放疗和免疫治疗等主要治疗手段取得了显著进展，但结直肠癌患者的预后仍然较差，这凸显了深入理解结直肠癌分子异质性以开发更有效个性化疗法的迫切性。

胆固醇作为细胞膜的结构成分，对于维持膜的完整性和流动性至关重要，同时也是胆汁酸和类固醇激素的前体，在细胞功能和信号通路中扮演着关键角色。肿瘤细胞对胆固醇的需求增加，以支持膜生物发生和其他基本功能，因此胆固醇代谢（Cholesterol Metabolism, CM）通过影响细胞增殖、迁移和侵袭，在癌症进展中发挥着重要作用。此外，胆固醇还会破坏免疫细胞的代谢稳态，从而抑制抗肿瘤免疫力。因此，揭示胆固醇代谢在肿瘤中的作用将增强我们对肿瘤发生的理解，并指导改善患者预后的治疗策略。

然而，胆固醇代谢在结直肠癌中的具体作用尚不完全清楚。为了解决这一问题，研究人员开展了这项研究，旨在根据胆固醇代谢相关基因识别结直肠癌的不同亚型，并揭示其独特的分子和免疫学特征。该研究发表于《Discover Oncology》。

为了开展研究，研究人员整合了多组学数据。他们从TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库获取了结直肠癌的RNA测序（RNA-seq）和全外显子组测序（WES）数据及临床信息，并从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库获取了包括GSE41258、GSE17536等的基因表达数据集以及GSE132465、GSE144735等的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。胆固醇代谢相关基因从GeneCards数据库获取。关键技术方法包括：基于胆固醇代谢相关基因对TCGA结直肠癌样本进行无监督聚类分析以鉴定亚型；使用CIBERSORT和xCell等算法进行免疫浸润分析；利用GISTIC 2.0进行拷贝数变异（CNV）分析；使用oncoPredict包预测药物敏感性，TIDE算法预测免疫检查点阻断（ICB）疗效；对单细胞RNA测序数据使用Seurat包进行标准预处理和分析，利用Harmony算法校正批次效应，通过copykat包区分恶性细胞，使用CytoTRACE评估细胞干性，通过CellChat分析细胞间通讯；最后利用LASSO-Cox回归构建胆固醇代谢相关预后标志物（CMRPS）并在独立数据集中验证。

3.1 Identification and characterization of CM subtypes in CRC

基于195个胆固醇代谢相关基因，研究人员将TCGA结直肠癌样本分为两个稳健的亚型：A亚型（n=161）和B亚型（n=332）。A亚型主要与胆固醇酯化和储存通路相关，提示细胞内胆固醇积聚倾向；而B亚型则富集于胆固醇代谢过程和分解代谢通路，表明其具有更有效的胆固醇管理系统。临床关联分析显示，A亚型患者具有更高的T分期（T stage），且更多肿瘤位于结肠（与直肠相比）。A亚型与共识分子分型（Consensus Molecular Subtypes, CMS）中的CMS4显著相关，并且微卫星不稳定性（Microsatellite Instability, MSI）比例更高。尽管MSI通常与较好预后相关，但A亚型患者的总生存期（Overall Survival, OS）和无复发生存期（Recurrence-Free Survival, RFS）均显著差于B亚型患者，这种不良预后关联在微卫星稳定（Microsatellite Stable, MSS）患者中也存在。

3.2 Transcriptomic signatures differentiated the two subtypes

转录组分析揭示了两个亚型不同的分子特征。A亚型表现出更高的衰老表型，包括更高的衰老评分和衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）相关基因的上调。A亚型还显著富集于炎症相关通路，如髓系细胞趋化和细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）组织。免疫浸润分析显示A亚型中巨噬细胞和中性粒细胞比例更高。相比之下，B亚型则显著富集于消化吸收、脂质和类固醇代谢以及过氧化物酶体功能相关通路，其代谢景观更接近正常结直肠上皮。

3.3 Distinct genomic instability pathways characterized the two CM subtypes

基因组景观分析发现，A亚型具有微卫星不稳定性（MSI）驱动的基因组不稳定性特征，表现为更高的肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden, TMB）、更高的高频突变基因突变率以及更多癌症进展相关信号通路（如细胞周期、Hippo、MYC、NOTCH、NRF2、PI3K和TGF-Beta通路）的突变。在MSS患者亚组中，A亚型和B亚型之间的TMB和信号通路突变谱无显著差异，表明A亚型总体突变负荷的增加主要由其MSI肿瘤富集所驱动。相反，B亚型表现出染色体不稳定性（Chromosomal Instability, CIN）特征，其拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）负荷显著高于A亚型。值得注意的是，APC基因在B亚型中的突变频率显著更高，而APC突变是结直肠癌中CIN的已知诱导因素。

3.4 Differential drug sensitivity and predicted immunotherapy response between CM subtypes

药物敏感性预测显示，A亚型对伊立替康和5-氟尿嘧啶更敏感，而B亚型对奥沙利铂更敏感。与A亚型衰老表型一致，其对抗衰老药物雷帕霉素的敏感性也更高。利用TIDE算法预测免疫治疗反应发现，在MSS患者中，A亚型的TIDE评分显著更高，预测的免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）应答者比例更低，提示其免疫逃逸潜力更高且对免疫治疗反应可能更差。在MSI患者中，两个亚型之间的TIDE评分和预测应答率无显著差异。

3.5 Single-cell atlas revealed distinct TME compositions of CM subtypes

单细胞RNA测序分析进一步揭示了两个亚型肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的差异。将样本划分为A亚型（n=14）和B亚型（n=15）后，共鉴定出12个不同的细胞群体。虽然大多数细胞类型在每个样本中都存在，但其比例在不同样本间存在差异。A亚型中髓系细胞、成纤维细胞和周细胞的丰度显著更高，而B亚型中浆细胞更丰富。

3.6 Characterizing the heterogeneity of tumor cells

恶性细胞分析证实，A亚型肿瘤细胞的胆固醇酯化和生物合成评分更高，而B亚型肿瘤细胞的胆固醇分解代谢评分更高。A亚型肿瘤细胞表现出更高的上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）和血管生成特征评分，以及更高的衰老评分；而B亚型肿瘤细胞则表现出更高的增殖评分和细胞干性（通过CytoTRACE评估）。细胞周期分析显示B亚型有更高比例的细胞处于S期和G2/M期。转录因子（Transcription Factor, TF）活性分析发现，CREB3L1和HIF1A在A亚型肿瘤细胞中活性上调，而CEBPA和MYC在B亚型中活性上调。

3.7 Differential roles of TAMs in shaping the TME of subtypes A and B

髓系细胞功能差异分析显示，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）可进一步分为三个亚群：TAM_SPP1、TAM_FCN1和TAM_MKI67。TAM_SPP1在A亚型TME中的比例显著高于B亚型，其高表达M2型巨噬细胞标志物（如MRC1, CD163）和免疫抑制标志物（如SIRPA, HAVCR2），并高表达胆固醇代谢相关基因（如APOE, ABCA1）。基因集富集分析（GSEA）显示TAM_SPP1富集于热反应和脂质转运通路，且衰老相关特征上调。细胞通讯分析发现，TAM_SPP1与成纤维细胞亚群Fibro_IL32之间存在最强的相互作用，主要通过TGF-β和SPP1信号通路，这与细胞外基质重塑和免疫排斥结构的形成有关。TAM_SPP1和Fibro_IL32高浸润的患者预后更差。相比之下，B亚型中的TAMs高表达HLA II类分子相关基因，并富集于抗原加工提呈和免疫反应通路，提示其在适应性免疫中可能扮演更重要的角色。

3.8 Construction and validation of a CM-related prognostic model

基于两个亚型间的差异表达基因（Differential Expression Genes, DEGs），研究人员利用LASSO-Cox回归和逐步回归筛选出5个关键预后基因（PCOLCE2, HOXC6, F7, EEF1A2, CALB1），构建了胆固醇代谢相关预后标志物（CM-related prognostic signature, CMRPS）。根据CMRPS评分中位数将患者分为高风险组和低风险组，Kaplan-Meier生存分析显示低风险组预后显著优于高风险组。该标志物在多个独立的GEO数据集中得到了验证，并且多变量Cox回归分析表明CMRPS是结直肠癌的独立预后因素。将CMRPS与性别、分期等临床因素结合，在多个数据集中均显示出较高的预测性能（通过时间依赖性受试者工作特征曲线，time-dependent ROC curve评估）。

4 Discussion

本研究首次基于胆固醇代谢相关基因对结直肠癌进行了系统分型，揭示了两种具有显著异质性的胆固醇代谢模式（A亚型：酯化/储存型；B亚型：分解代谢/稳态型），并深入阐述了其在临床特征、基因表达、基因组变异、肿瘤微环境、治疗反应及预后方面的差异。A亚型与衰老表型、炎症激活、免疫抑制微环境（富含TAM_SPP1和成纤维细胞）、不良预后以及对免疫治疗的可能抵抗相关；而B亚型则表现出更活跃的代谢和增殖状态以及相对有利的免疫微环境。单细胞分辨率分析揭示了肿瘤细胞内在特征（如EMT、干性）和肿瘤微环境细胞（特别是TAM_SPP1与成纤维细胞的相互作用）在塑造亚型特异性表型中的关键作用。所构建的CMRPS预后标志物具有良好的预测性能。这些发现深化了对结直肠癌异质性的理解，强调了胆固醇代谢在肿瘤生物学中的核心地位，为开发基于代谢分层的个性化治疗策略（如针对SOAT1、SPP1等靶点）提供了重要的理论依据和潜在的临床转化工具。研究的局限性包括回顾性设计、队列异质性以及缺乏功能性实验验证，未来需要在前瞻性队列和实验模型中进一步验证这些发现并阐明其分子机制。

5 Conclusions

总之，本研究系统地表征了胆固醇代谢在结直肠癌中的作用，鉴定出两种不同的胆固醇代谢亚型，并深入探讨了它们与临床特征、潜在生物学机制、治疗反应和肿瘤微环境的关联。这些发现增强了对结直肠癌异质性的理解，表明基于胆固醇代谢的分型可以作为一个框架，用于进一步研究个性化治疗策略。