基于香草醛/乙基香草醛特异性受体的芳香增强剂的筛选及其协同作用机制

《Journal of Future Foods》：Screening of sweet-smelling enhancing odorants based on vanillin/ethyl vanillin-specific receptors and their synergistic mechanisms

　　甜味增强香精筛选及协同机制研究：通过感官评价与分子动力学模拟发现，呋喃醇醋酸酯、麦角甾三烯酮、戴马森酮和β-戴马森酮与香兰素/乙基香兰素协同作用时，与OR2J2受体的结合能显著降低（-8.11至-10.85 kcal/mol），且通过氢键（Arg123、Phe141、Cys142、Phe207）和疏水作用稳定受体构象，促进嗅觉信号传导。

　　在食品科学与感官研究领域，香气感知是影响人们味觉体验的重要组成部分。这种感知主要来源于味觉、嗅觉和触觉系统的协同作用，其中嗅觉在整体体验中占据着主导地位，贡献了大约80%的感知效果。为了更好地理解和优化香气感知，特别是针对那些能够增强甜香感的芳香化合物，本研究结合了感官评估与分子对接（MD）分析，探索了香草醛（Vanillin, V）和乙基香草醛（Ethyl vanillin, EV）特异性受体的筛选方法及其协同作用机制。研究通过感官测试和分子动力学模拟，确定了四种表现出最佳甜香增强能力的芳香化合物：呋喃醇乙酸酯（Furaneol acetate）、麦角甾三烯酮（Megastigmatrienone）、大马酮（Damascenone）和β-大马酮（β-Damascone）。这些化合物通过与V和EV共同结合，显著提高了它们对某些嗅觉受体的结合亲和力，使得结合能从单个配体的-5.40到-6.12 kcal·mol?1下降至配体-协同剂复合物的-8.11到-10.85 kcal·mol?1。研究进一步发现，OR2J2在这些受体中表现出最强的结合能力，通过20 ns的分子动力学模拟验证了其三元复合物的稳定性（RMSD < 2.0 ?）。通过残基分析，研究指出OR2J2的变构调节机制能够引发协同效应，尤其是在跨膜区TM2、TM3、TM5，以及胞内环IC2和胞外环EC2区域。具体而言，OR2J2结合位点中的精氨酸123（Arg123）、苯丙氨酸141（Phe141）、半胱氨酸142（Cys142）和苯丙氨酸207（Phe207）等残基通过氢键作用在复合物稳定中起着关键作用。同时，疏水相互作用虽然可用位点较少，但能有效集中配体结合，提升整体感知效果。

### 香气协同效应的机制与研究意义

香气协同效应是指通过多种机制实现的非线性增强效果。首先，气味融合可以降低检测阈值，例如2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚和香草醇可以降低香草醛的检测阈值。其次，负向气味抑制可能在某些情况下发生，例如芳樟醇与茴香脑的组合可以掩盖鱼腥味。此外，受体层面的相互作用也可能影响香气感知，通过疏水和亲水相互作用调节感知强度。例如，橙汁中的化合物如(+)-柠檬烯、芳樟醇和香叶醛可以与嗅觉受体OR1A1、OR1D2和OR2W1相互作用，丰富香气感知。当前，针对V和EV的二元混合物的协同效应研究仍较为有限，因此需要更深入的探索。

为了系统地研究这些协同效应，本研究采用了一种结合感官筛选与分子对接和分子动力学模拟的方法。首先，通过S曲线和σ-τ分析筛选出12种能够增强甜香的芳香化合物。随后，使用分子对接技术分析这些化合物与V和EV之间的相互作用，并进一步通过分子动力学模拟评估形成的受体-配体复合物的动态稳定性。这一方法不仅提供了分子层面的见解，还揭示了风味协同作用的潜在机制。然而，由于天然食品香气通常由复杂的混合物组成，单独分析单一化合物与受体的相互作用是不够的，因此需要系统地研究受体与二元或多元化合物的相互作用。

### 研究方法与技术细节

本研究使用了多种化学物质，包括香草醛（V）、乙基香草醛（EV）、吲哚（Skatole）、α- angelica 乳酮（α-angelica lactone）、β-angelica 乳酮（β-angelica lactone）、4-乙基-2-甲氧基苯酚（4-ethyl-2-methoxyphenol）、呋喃醇（Furaneol）、呋喃醇乙酸酯（Furaneol acetate）、麦角甾三烯酮（Megastigmatrienone）、3,4-二甲基-1,2-环戊二酮（3,4-dimethyl-1,2-cyclopentanedione）、3,5-二甲基-1,2-环戊二酮（3,5-dimethyl-1,2-cyclopentanedione）、大马酮（Damascenone）、β-大马酮（β-Damascone）以及4,5-二甲基-3-羟基-2,5-二氢呋喃-2-酮（4,5-dimethyl-3-hydroxy-2,5-dihydrofuran-2-one）。这些化学物质均为分析级，除特别说明外，均从Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海，中国）获得。此外，超纯水来自Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.（杭州，中国）。其中，编号为2#、5#、6#、8#、9#、12#的芳香化合物是基于先前的深度学习预测和初步感官评估而被特别选择的，以评估它们作为增强V和EV甜香的协同剂的潜力。其余六种芳香化合物则是通过香水师的初步感官评估获得，显示出其增强甜香的特性。值得注意的是，吲哚（Skatole）的香气特征在不同浓度下有所变化，低浓度时表现为甜味，而高浓度则呈现粪臭味。

为了确定嗅觉阈值，研究采用了3-替代强制选择（3-AFC）方法，依据GB/T 22366-2022/ISO 13301:2018标准进行。首先通过初步筛选确定每种芳香化合物的最高可检测浓度，然后通过连续稀释法（稀释因子为2）制备一系列稀释浓度。在每次试验中，评估者对三个随机编码的样品进行评估，其中包含一种含有芳香化合物的样品和两个空白样品。评估者被要求识别含有目标芳香化合物的样品。通过统计分析在不同浓度水平上的检测概率（p），并使用调整概率公式（P = (3p - 1)/2）进行校正，以排除偶然因素。研究还通过拟合S型函数来确定嗅觉阈值，即当检测概率P = 0.5时的浓度。通过比较实验测定的混合物阈值（OT_exp）与理论阈值（OT_Feller），可以分类出四种相互作用效果：妥协效应（OT_exp = OT_Feller）、加性效应（50% OT_Feller < OT_exp < 100% OT_Feller）、掩盖效应（OT_exp > 100% OT_Feller）和协同效应（OT_exp < 50% OT_Feller）。研究发现，协同效应在某些芳香化合物与V/EV的组合中显著存在，例如编号为6#、10#和11#的化合物，它们的实验/理论阈值比值在0.39到0.48之间，表明这些化合物能够显著增强V和EV的甜香感知。

为了进一步分析这些芳香化合物与V/EV之间的相互作用，研究采用了σ-τ方法。该方法通过训练评估者对二元混合物和单一芳香化合物的香气强度进行评分，使用9分结构化量表（1-9），其中1表示非常微弱，5表示适中，9表示非常强烈。评估者还对V/EV相关的香气特征进行了量化分析。通过对不同浓度水平的香气强度进行评估，研究确定了每种芳香化合物的强度范围，并将其划分为2-9的强度等级。对于协同效应的分析，研究将目标芳香化合物调整为强度等级1，然后加入预调整为强度等级3的V/EV溶液中，对混合物的香气强度进行评估。实验数据被绘制在σ-τ图上，其中σ表示实际检测强度与理论强度的比值，τ表示个体成分的相对贡献。通过这一方法，研究能够系统地评估不同芳香化合物与V/EV之间的协同效应。

### 分子对接与分子动力学模拟

为了更深入地理解这些芳香化合物与V/EV的协同机制，研究采用了双分子同步对接（BSD）和双分子动力学（BMD）模拟。首先，通过BSD分析，确定了四种能够与V或EV协同增强甜香的芳香化合物。这些化合物与V/EV共同结合时，显著提高了它们对OR2J2、OR10G3、OR10G4和OR10G9等受体的结合亲和力。具体而言，V/EV单独存在时的结合能为-5.40到-6.12 kcal·mol?1，而在协同系统中，结合能下降至-8.11到-10.85 kcal·mol?1。这种结合能的显著下降表明，芳香化合物与V/EV的协同作用可能通过增强受体激活来实现。研究进一步发现，OR2J2与芳香化合物形成的复合物具有最高的结合亲和力，表明该受体对V/EV的协同作用具有高度敏感性。

通过分子动力学模拟，研究评估了这些芳香化合物与V/EV结合后形成的复合物的动态稳定性。模拟结果显示，所有复合物在20 ns的模拟时间内保持了稳定的构象，其RMSD（均方根偏差）均低于2.0 ?。在初始结合阶段（0-7 ns），观察到显著的构象调整，表现为RMSD值的升高。随后，系统进入平衡和稳定阶段，显示出更坚固的结构特性。值得注意的是，OR2J2与编号为11#的芳香化合物（β-大马酮）形成的复合物表现出特别的稳定性，其RMSD值低于0.4 ?，这可能与β-大马酮的结构特性有关。通过比较0 ns和20 ns时的结合构型，研究发现芳香化合物的结合不仅增加了疏水相互作用的数量，还重新组织了氢键网络，表明其通过双重稳定机制增强了EV的结合亲和力。这一模式在所有测试的二元系统中都得到了验证，说明编号为7#的芳香化合物（麦角甾三烯酮）在OR2J2激活中具有普遍的调节作用。

### 残基分析与结构稳定性

进一步的残基分析揭示了OR2J2与这些芳香化合物结合时的结构变化。研究发现，OR2J2的结合位点中存在多个关键残基，如精氨酸123（Arg123）、苯丙氨酸141（Phe141）、半胱氨酸142（Cys142）和苯丙氨酸207（Phe207），这些残基通过氢键相互作用在复合物的稳定中发挥重要作用。同时，疏水相互作用虽然可用位点较少，但能有效集中配体结合，提升整体感知效果。研究还发现，某些芳香化合物（如编号为6#的呋喃醇乙酸酯）能够通过改变受体的构象，增强V或EV的结合亲和力。这种构象变化可能通过变构调节机制实现，即芳香化合物通过招募不同的氨基酸残基，微妙地改变受体的结合口袋结构，从而优化配体-受体的互补性或下游信号传递效率。

此外，研究通过聚类分析进一步揭示了受体-芳香化合物复合物的动态行为。在20 ns的分子动力学模拟中，发现两种持续的结合模式类别，分别对应不同的受体构象变化。其中，第一类（如EV+6#、V+7#、EV+7#、EV+10#）在整个模拟过程中保持了独特的结合特征，而第二类则包含了其余的组合。这种分类保留了初始的广泛分组，尽管参与的残基在模拟过程中发生了逐步变化。研究还发现，V和EV在OR2J2的结合过程中主要与跨膜区TM2、TM3、TM5，以及胞内环IC2和胞外环EC2等关键结构元素相互作用。特别是IC2和TM2形成的连续相互作用簇，强调了它们在配体结合中的协同作用。协同组合（如V+6#和EV+10#）表现出比初始构型更高的结合占有率（从六个到八个残基），表明它们在受体核心中的结合更加稳固。

### 研究结论与未来展望

本研究的结论表明，呋喃醇乙酸酯、麦角甾三烯酮、大马酮和β-大马酮是四种能够显著增强V和EV甜香的芳香化合物。这些化合物通过与V和EV的协同作用，稳定了OR2J2的结合口袋，主要通过精氨酸123、苯丙氨酸141、半胱氨酸142和苯丙氨酸207等关键残基的氢键相互作用。这种构象稳定性有助于受体的激活，从而解释了观察到的感知强度增强现象。尽管疏水相互作用的可用位点较少，但它们能够有效集中配体结合，提高整体感知效果。

研究还指出，这些芳香化合物与V/EV的协同作用不仅涉及受体激活，还可能通过改变受体的结合口袋结构，增强配体-受体的互补性或下游信号传递效率。这种协同效应为理解香气增强机制提供了分子基础，并为开发能够增强甜香感知的芳香组合提供了理论依据。未来的研究应进一步探索这些芳香化合物与不同受体之间的结构-活性关系，结合定向化学实验和感官测试，以更全面地揭示协同效应的分子机制，并拓展其在食品调味中的应用范围。此外，研究还建议采用更长时间尺度的模拟、显式脂质双分子层和多受体模型，以更准确地模拟受体-配体的动态行为，并通过功能验证（如异源受体表达实验、嗅觉神经元记录和定向心理物理测试）将分子相互作用与受体反应和感知结果联系起来。这些方法的结合将有助于更深入地理解香气协同作用的复杂性，并推动食品风味工程的发展。