使用MALDI-TOF质谱技术鉴定Legionella anisa、Legionella longbeachae和Legionella pneumophila：以环境分离株为对象的方法验证研究

《Journal of Microbiological Methods》：Identification of Legionella anisa, Legionella longbeachae and Legionella pneumophila using MALDI-TOF MS: A method validation study with environmental isolates

　　MALDI-TOF MS有效鉴定环境军团菌属（L. anisa、L. longbeachae、L. pneumophila）物种，24小时培养结合直接转移法最佳，灵敏度94.6%-100%、特异性100%，重复性和可重复性良好，为环境样本快速检测提供可靠方法。

　　本研究探讨了使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对三种常见的军团菌物种进行分类鉴定的有效性。这三种军团菌包括*Legionella anisa*、*Legionella longbeachae*和*Legionella pneumophila*。军团菌是一种广泛存在于自然环境和人工水系统中的细菌，它们可以引起人类感染，称为军团菌病。这种疾病可能表现为严重的肺炎，即军团菌肺炎，或较轻的类似流感症状，如庞蒂亚热，甚至偶尔出现非肺部感染。军团菌主要通过吸入受污染的水雾或尘埃传播，或者通过伤口感染或肺部吸入含军团菌的水。

目前已有67种军团菌被发现，其中约30种与军团菌病有关。在欧洲、澳大利亚和美国，每年每百万居民中观察到约10至15例军团菌肺炎病例。然而，这种疾病的发病率因国家而异，这取决于不同地区的监测和报告水平。由于城市化、气候变化和监测技术的进步，军团菌病的发病率正在上升。因此，改进用于环境军团菌监测的技术对于风险管理和疾病预防至关重要。

目前，用于军团菌鉴定的方法包括培养、尿液抗原检测、分子方法和血清学方法。然而，这些方法存在一些局限性，如速度慢、交叉反应、操作繁琐或只能识别*L. pneumophila*或其血清群1。相比之下，MALDI-TOF MS作为一种快速、经济有效的鉴定方法，具有识别多种军团菌物种的潜力。该技术通过分析细菌的蛋白质图谱，能够在短时间内完成物种级别的鉴定。

在本研究中，我们验证了MALDI-TOF MS对*L. anisa*、*L. longbeachae*和*L. pneumophila*的分类能力，并评估了不同培养时间和样本准备方法对鉴定结果的影响。我们还比较了MALDI-TOF MS与其他常用鉴定方法（如16S rRNA测序、乳胶凝集试验和荧光测试）的性能。通过这些比较，我们希望确认MALDI-TOF MS在军团菌分类中的准确性和可靠性。

本研究使用了65株环境分离的军团菌菌株以及5株ATCC参考菌株。这些菌株主要来自芬兰2016年至2022年的军团菌病病例调查。为了验证MALDI-TOF MS的性能，我们进行了16S rRNA测序、乳胶凝集试验和荧光测试，并将这些结果与MALDI-TOF MS的结果进行比较。对于大多数菌株，这些测试在最初分离时已经完成，即在本研究之前。对于缺乏测序、乳胶凝集或荧光结果的菌株，或与MALDI-TOF MS结果矛盾的菌株，我们进行了额外的测试或重新测试。在某些情况下，由于16S rRNA测序未能准确识别菌株，我们对这些菌株进行了重新分析。

在样本准备方面，我们使用了两种方法：直接转移法和提取法。直接转移法涉及将细菌质量直接涂抹在目标板上，而提取法则需要使用乙醇和甲酸等试剂进行处理。在培养时间上，我们分析了24小时和48小时的培养结果，并比较了它们对鉴定结果的影响。此外，我们还进行了重复性和再现性分析，以评估该方法在不同操作者之间的稳定性和一致性。

研究结果表明，无论使用哪种样本准备方法或培养时间，63株环境菌株和参考菌株都被正确鉴定到物种级别。其中，23株*L. anisa*菌株中有20株被正确鉴定为*L. anisa*，而3株未能准确鉴定，其中2株被误认为*L. pneumophila*。在*L. longbeachae*的8株菌株中，7株被正确鉴定，而1株在24小时和提取法下被鉴定为*L. longbeachae*，而在48小时和直接转移法下被误认为*L. pneumophila*。对于*L. pneumophila*的37株菌株，35株被正确鉴定，而2株在某些情况下被误认为*Staphylococcus epidermidis*。

统计分析显示，培养时间和样本准备方法对MALDI-TOF MS的鉴定结果有显著影响。对于*L. anisa*，48小时培养和提取法的得分中位数显著高于24小时培养和提取法或48小时培养和直接转移法。对于*L. longbeachae*，48小时培养和提取法的得分中位数显著低于24小时培养和提取法或48小时培养和直接转移法。而对于*L. pneumophila*，24小时培养和直接转移法的得分中位数显著高于48小时培养和提取法。

这些结果表明，MALDI-TOF MS在鉴定军团菌方面具有很高的准确性和可靠性，无论使用哪种样本准备方法或培养时间。此外，该方法在重复性和再现性方面表现良好，标准差和变异系数均较小，表明结果的一致性较高。尽管在某些情况下，不同菌株的鉴定结果存在差异，但这些差异通常与菌株本身的特性或样本准备方法有关，而不是技术本身的不稳定性。

研究还发现，某些菌株可能因样本污染或混合生长而被误鉴定。例如，两株*L. anisa*菌株和一株*L. longbeachae*菌株被误认为*L. pneumophila*，这可能是由于样本污染或混合生长。此外，*L. sainthelensi*菌株在某些情况下可能被误认为*L. longbeachae*，这可能与蛋白质图谱的相似性有关。

本研究的结论是，MALDI-TOF MS能够有效地对环境分离的*L. anisa*、*L. longbeachae*和*L. pneumophila*菌株进行物种级别的鉴定，且在24小时的培养时间后即可获得可靠的结果。使用直接转移法和提取法进行样本准备时，MALDI-TOF MS的性能相近，表明这两种方法在鉴定过程中具有相似的效果。此外，该技术的高准确性和可靠性使其成为环境军团菌监测的有力工具，有助于提高疾病监测和风险评估的效率。

研究还强调了MALDI-TOF MS在成本效益方面的优势。与传统的分子方法（如脉冲场凝胶电泳、多基因序列分型和全基因组测序）相比，MALDI-TOF MS的分析成本更低，操作更简便。这种技术的快速和经济性使其在实际应用中具有很大的潜力，特别是在大规模环境样本分析和临床诊断中。然而，研究也指出，尽管MALDI-TOF MS在鉴定过程中表现出色，但最终的鉴定结果仍应由专家进行评估，以确保准确性。

综上所述，本研究验证了MALDI-TOF MS在鉴定环境军团菌菌株方面的有效性，并展示了其在不同培养时间和样本准备方法下的稳定性。该技术的高准确性和可靠性使其成为军团菌病监测和研究的重要工具，有助于提高诊断速度和成本效益，从而更好地管理军团菌相关的健康风险。