提高天然提取物生物活性和稳定性的新方法：二氧化碳辅助压缩NADES技术及微囊化处理

《The Journal of Supercritical Fluids》：New approaches for improving bioactivity and stability of natural extracts: CO 2-assisted compressed NADES and microencapsulation

　　CO?辅助压溶剂提取法优化橙子副产物中生物活性化合物提取，结合微胶囊化技术显著提升稳定性和神经保护活性，延长保质期至4个月以上。

　　本研究聚焦于通过一种基于天然深共熔溶剂（NADES）的提取技术，从橙子副产品中回收具有生物活性的化合物，特别是酚类和萜类化合物，以期实现神经保护效果。该研究中采用的CO?辅助高压NADES提取方法在提取效率和生物活性方面优于传统方法。此外，通过优化微胶囊化工艺，进一步提升了提取物的稳定性，使其能够在较长时间内保持生物活性和功能。本研究的创新之处在于首次将NADES与CO?辅助高压提取技术结合，并通过微胶囊化手段提升提取物的保存期限，从而为食品和营养补充剂行业提供了新的研究方向和应用前景。

### 一、研究背景

橙子作为一种全球重要的柑橘类水果，其果汁是主要的加工产品之一。然而，仅有约40%的果实重量被用于果汁生产，其余部分则作为副产品，包括果皮、果肉和果核等。这些副产品富含多种生物活性成分，如碳水化合物、精油、萜类化合物、维生素和酚类化合物，这些成分在预防与延缓年龄相关慢性疾病方面展现出潜在的积极作用。其中，阿尔茨海默病（AD）和其他神经退行性疾病正以惊人的速度在全球范围内增加，目前尚无有效的治愈手段。AD的特征包括记忆力减退和认知能力下降，这些症状与β-淀粉样蛋白斑块、tau蛋白过度磷酸化、胆碱能功能障碍、氧化应激和神经炎症密切相关，这些因素共同加剧了神经元的损伤。

现有的治疗手段主要集中在缓解症状上，而具有抗氧化、抗炎和胆碱酯酶抑制作用的天然生物活性化合物，因其在预防AD方面的潜力，正受到越来越多的关注。这类化合物通常存在于柑橘类副产品中，因此，开发高效的提取技术对于充分利用这些资源具有重要意义。传统的提取方法多采用乙醇或水等绿色溶剂，但近年来，NADES因其独特的氢键网络、热稳定性、低挥发性和在酚类化合物提取中的高效性，逐渐成为一种更优的替代方案。NADES由水溶性组分如糖类、氨基酸和羧酸组成，不仅具备可调节的性质，而且符合GRAS（公认安全）标准，相较于传统有机溶剂更具环境友好性。

将NADES与高压提取技术结合，提供了一种新颖的途径，以获得高纯度的生物活性提取物。然而，水溶性NADES的高粘度可能限制其溶剂渗透能力和质量传递效率，从而影响提取效果。为解决这一问题，研究者提出了结合超临界CO?的双相系统，该系统通过CO?降低NADES的粘度并增强天然化合物的回收率。此外，天然提取物的保存期限较短，容易受到环境降解和消化过程的影响，因此，采用微胶囊化技术如脂质体微胶囊化，有助于提高其稳定性并实现靶向释放，从而延长其有效寿命。

### 二、研究材料与方法

本研究中使用的橙子副产品为未进一步加工的橙汁生产残留物，由Huelva, Spain的J. García Carrión, S.L.提供。该副产品包括果皮、剩余果肉和果核，接收后进行了清洗和均质处理，以去除可见的变质部分，并将其切成约2厘米大小的均匀块状物，以便于干燥。随后，材料被均匀分布在托盘上，并在-84.5°C和4800帕的压力下进行冷冻干燥，持续7天。干燥后的生物质通过实验室刀式研磨机进行研磨，并筛分至250-1000微米的粒径范围。最终提取物被真空密封并储存在-20°C，直至进一步使用。

在提取过程中，使用了食品级的CO?（纯度为99.9%），由Carburos Metálicos（Madrid, Spain）提供。实验中还使用了超纯水（符合ASTM类型I标准）、HPLC级乙醇、甲基叔丁基醚、LC-MS级甲醇、氯仿、硫酸（98%）、乙酸乙酯和甘油等试剂，均购自VWR（Barcelona, Spain）。此外，还使用了多种生物活性化合物，如乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）、乙酰硫胆碱碘化物（ACth）、丁酰胆碱酯酶碘化物（BCth）、亚油酸（LA）、2,2’-联氮-三甲基-5-磺酸盐（ABTS）、2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基-色烷-2-羧酸（Trolox）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、二钠磷酸盐（Na?HPO?）、单钾磷酸盐（KH?PO?）、硝普钠二水合物（SNP）、荧光素钠盐、磺胺、萘基乙二胺二盐酸盐、没食子酸、Folin-Ciocalteu试剂、槲皮素、柠檬烯（分析纯）和全反式-β-胡萝卜素（纯度≥97%）等，均购自Sigma-Aldrich（Madrid, Spain）。

此外，还使用了大豆磷脂酰胆碱（来自大豆卵磷脂）和向日葵卵磷脂（非精炼）作为微胶囊化剂，分别由Thermo Scientific GmbH（Karlsruhe, Germany）和Moara（Madrid, Spain）提供。所有实验均在96孔板上进行，并使用Cytation 5成像读数器（BioTek Instruments, Winooski, VT, USA）进行光谱和荧光检测。

### 三、研究方法与实验设计

为了评估不同类型的水溶性NADES对橙子副产品中生物活性化合物的提取效果，研究者测试了三种NADES：胆碱氯化物与甘油（1:2，ChCl:Gly）、甜菜碱与甘油（1:2，Bet:Gly）和乳酸与胆碱氯化物（1:1，Lac:ChCl）。实验条件为30%的溶剂体积、50°C、10 MPa、30分钟的静态和封闭模式。此外，还进行了超声波辅助提取（UAE）和气体膨胀液体（GXL）提取的对比实验，以验证NADES提取方法的优越性。

在微胶囊化优化阶段，研究者采用Box-Behnken设计，对浓度（200–5000 ppm）、搅拌时间（10–180分钟）和温度（35–80°C）进行了优化。响应变量包括总萜类化合物（TTC）、总类胡萝卜素（TCC）和总酚类化合物（TPC）的微胶囊化效率，以及神经保护活性（如AChE抑制和抗氧化能力）。实验数据通过统计分析方法进行处理，包括期望函数和响应面法，以确定最优条件。

### 四、实验结果与讨论

实验结果显示，采用CO?辅助高压NADES提取的方法在提取效率和生物活性方面均优于传统方法。其中，Bet:Gly（1:2）NADES在提取总萜类化合物和酚类化合物方面表现尤为突出，其提取效率比GXL-EtAc提取高出56%。此外，该方法在提取总酚类化合物和抗氧化活性方面也显示出显著优势，比GXL-EtAc提取高出114%。这些结果表明，Bet:Gly（1:2）的适度极性和广泛的氢键网络，有助于溶解不同极性的化合物，包括疏水性的萜类和亲水性的酚类。同时，CO?辅助高压条件下的粘度降低和扩散性增强进一步促进了质量传递，从而提高了提取效率。

在微胶囊化过程中，研究者发现采用大豆磷脂酰胆碱作为微胶囊化剂时，类胡萝卜素、萜类化合物和酚类化合物的微胶囊化效率分别为66%、34%和80%。然而，当使用非精炼向日葵卵磷脂作为微胶囊化剂时，其对萜类和酚类化合物的微胶囊化效率分别提高了18%和15%，显著增强了潜在的神经保护能力。这一改进不仅提升了生物活性成分的保留率，还增强了微胶囊的稳定性，使其在储存期间保持较高的功能活性。

在化学成分分析方面，研究者通过气相色谱-质谱（GC-MS）和高效液相色谱-二极管阵列检测-电喷雾电离-质谱（HPLC-DAD-ESI-MS/MS）对提取物和微胶囊化产品进行了分析。结果显示，微胶囊化产品能够有效保留大部分生物活性化合物，尤其是类胡萝卜素和酚类化合物，其微胶囊化效率分别为68%和89%。这些结果验证了微胶囊化方法的有效性，并支持了该方法在生物活性成分保护中的应用前景。

在稳定性测试中，研究者比较了原始提取物和微胶囊化产品在常温（21°C）和加速条件（45°C）下的表现。结果表明，原始提取物在储存过程中迅速降解，而微胶囊化产品则表现出更高的稳定性，能够保持生物活性成分的功能长达四个月。这主要归因于脂质双分子层形成的屏障作用，能够有效阻挡氧气和光照，从而延缓酚类和萜类化合物的氧化过程。此外，微胶囊化过程中的残留NADES可能增强了提取物的矩阵兼容性，为其提供了额外的保护环境。

### 五、结论

本研究通过CO?辅助高压NADES提取和后续的微胶囊化工艺，显著提升了从橙子副产品中回收生物活性化合物的效率、稳定性和神经保护潜力。Bet:Gly（1:2）NADES在提取酚类和萜类化合物方面表现出色，而CO?的引入则有效降低了NADES的粘度，提高了质量传递效率。微胶囊化技术，特别是使用非精炼向日葵卵磷脂作为微胶囊化剂，进一步增强了提取物的稳定性，使其能够在更长时间内保持生物活性和功能。这些成果不仅为柑橘类副产品的高值化利用提供了新的思路，也为食品和营养补充剂行业开发稳定、高效的生物活性成分提取技术奠定了基础。此外，该方法在环境友好性方面也具有优势，能够减少对传统有机溶剂的依赖，提高整个过程的可持续性。