人血浆源性含eNAMPT的细胞外囊泡通过促进NAD+生物合成和小鼠产热发挥抗衰老潜力

《npj Aging》：Human plasma-derived eNAMPT-containing extracellular vesicles promote NAD+ biosynthesis and thermogenesis in mice

　　本研究针对衰老过程中组织NAD+水平下降的关键问题，探索了人血浆来源的含eNAMPT细胞外囊泡(eNAMPT-EVs)作为NAD+增强剂的潜力。研究人员通过超速离心纯化eNAMPT-EVs，发现其能在细胞和小鼠下丘脑中有效提升NAD+水平，并诱导产热相关生理反应。该研究揭示了运动提升血浆eNAMPT水平的机制，为开发基于eNAMPT-EVs的抗衰老干预策略提供了重要依据。

　　

随着全球人口老龄化加剧，深入理解衰老的生物学机制并开发有效的干预策略已成为生命科学领域的迫切任务。在众多衰老标志中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺)的年龄相关性下降尤为引人关注。NAD⁺不仅是能量代谢中的关键辅酶，还是sirtuins、PARPs等重要酶类的底物，参与调控DNA修复、代谢平衡和应激反应等多种细胞过程。过去十年的研究表明，多种组织中NAD⁺水平随年龄增长而下降，这一现象与年龄相关的功能衰退和疾病发生密切相关。因此，"NAD⁺增强"(NAD⁺ boosting)策略——即通过补充NAD⁺前体或提升其生物合成能力来对抗衰老——已成为抗衰老研究的热点。

在NAD⁺生物合成途径中，烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT)是哺乳动物体内的限速酶，负责催化从烟酰胺(Nicotinamide, Nam)到烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide, NMN)的关键步骤。有趣的是，研究发现脂肪组织能够将NAMPT包裹在细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)中，以细胞外NAMPT(extracellular NAMPT, eNAMPT)的形式分泌到血液循环中。这些含eNAMPT的细胞外囊泡(eNAMPT-EVs)能够被多种组织摄取，特别是在下丘脑——一个控制衰老和长寿的中枢区域——中促进NAD⁺的生物合成。先前的研究表明，从年轻小鼠血浆中提取的eNAMPT-EVs能够显著提高老年小鼠下丘脑中的NAD⁺水平，延缓衰老并延长最大寿命。这些发现暗示eNAMPT-EVs可能作为一种新型的抗衰老NAD⁺增强剂，但人血浆来源的eNAMPT-EVs是否具有相同的功能尚不清楚。

为了回答这一问题，由Kiyoshi Yoshioka、Takumi Sugimoto、Mamoru Oyabu、Naoki Ito、Aoi Kodama、Yasutomi Kamei和Shin-ichiro Imai组成的研究团队在《npj Aging》上发表了他们的最新研究成果。他们系统地评估了人血浆源性eNAMPT-EVs在促进NAD⁺生物合成和诱导生理反应方面的潜力，并探索了运动对这一过程的调节作用。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：通过超速离心技术从人和小鼠血浆以及脂肪细胞培养上清中纯化细胞外囊泡；使用高效液相色谱法(HPLC)精确测定细胞和组织中的NAD⁺水平；利用蛋白质印迹法(Western blotting)分析eNAMPT的摄取和信号通路蛋白的表达与磷酸化；通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测下丘脑中相关基因的mRNA表达变化；建立小鼠运动模型（跑台运动和自愿转轮运动）以研究运动对eNAMPT和NAD⁺水平的影响；并通过体温测量和炎症因子ELISA检测来评估eNAMPT-EVs的生理效应。研究所用的人血浆样本购自Biopredic International。

小鼠血浆eNAMPT被细胞内化并促进HEK293细胞和小鼠中的NAD⁺生物合成

研究团队首先建立了一个能够测量eNAMPT-EVs的NAD⁺生物合成活性的生物测定方法。他们将10%的小鼠血浆与HEK293细胞共培养20分钟后，通过蛋白质印迹分析清晰地观察到了小鼠eNAMPT被细胞摄取的现象。在加入10%小鼠血浆60分钟后，HEK293细胞内的NAD⁺水平显著升高。更重要的是，通过超速离心从小鼠血浆中纯化的eNAMPT-EVs同样能够成功提高HEK293细胞中的NAD⁺水平。为了确认这种NAD⁺的增加确实是由EVs中所含的eNAMPT介导的，研究人员使用了Nampt基因敲低(Nampt-KD)的OP9脂肪细胞。结果显示，从Nampt-KD OP9脂肪细胞培养上清中收集的EVs几乎不含eNAMPT，并且无法提升HEK293细胞的NAD⁺水平，这明确证明了EVs中的eNAMPT是导致受体细胞NAD⁺升高的原因。体内实验进一步证实，将从4月龄小鼠血浆中纯化的eNAMPT-EVs注射给20月龄的老年小鼠后，其下丘脑中的NAD⁺水平显著增加。这些结果共同表明，从小鼠血浆中纯化的eNAMPT-EVs在培养细胞和小鼠体内均表现出NAD⁺生物合成活性。

人血浆来源的超速离心纯化eNAMPT-EVs促进培养细胞和小鼠中的NAD⁺生物合成

接下来，研究人员将目光转向人血浆。他们发现，将10%的人血浆与HEK293细胞共培养后，同样可以检测到人eNAMPT的摄取以及细胞NAD⁺水平的显著升高。从同一人血浆中通过超速离心纯化的EVs（该过程去除了大部分白蛋白和转铁蛋白等杂质）也能显著增加细胞NAD⁺水平。为了验证这些NAD⁺的增加是否确实由人eNAMPT负责，他们使用了高效的NAMPT抑制剂FK866。尽管FK866本身在60分钟内会适度降低对照细胞的NAD⁺水平，但人血浆或其纯化EVs所引起的NAD⁺增加效应，在FK866预孵育后被完全消除，这强有力地证明NAD⁺的升高是由EVs中所含的人eNAMPT引起的。研究人员还注意到，不同个体的人血浆样本中eNAMPT含量存在差异。当他们使用eNAMPT含量很高(hP-A)和很低(hP-B)的两种血浆样本时，在低浓度(1%)添加条件下，可以检测到两者在提升HEK293细胞NAD⁺能力上的显著差异，并且这种差异同样存在于从这两种血浆纯化的EVs中，且可被FK866阻断。最重要的是，将混合人血浆样本纯化的EVs静脉注射给正常小鼠后，小鼠下丘脑中的NAD⁺水平也显著增加。这些结果综合表明，从人血浆中纯化的eNAMPT-EVs能够在培养细胞和小鼠体内促进NAD⁺生物合成。

运动增加循环eNAMPT并激活下丘脑中与NAD⁺代谢相关的信号通路

运动已被证明能够对抗小鼠和人类的衰老。有报道称，单次运动可以增加年轻、身体活跃个体循环中的eNAMPT水平。因此，研究人员探究了运动是否能引起小鼠循环eNAMPT增加并提高下丘脑NAD⁺水平。当年轻小鼠进行40分钟的跑台运动（包括10分钟的加速阶段）后，其血浆eNAMPT水平显著升高。尽管eNAMPT增加了，但在运动40分钟后甚至延长采样时间至70分钟后，并未观察到下丘脑NAD⁺水平的同步增加。研究人员推测，这可能是因为NAD⁺的周转也同时被激活了。如果是这样，他们应该能在运动小鼠的下丘脑中检测到SIRT1活性增加的读数。果然，他们发现单次运动显著增强了下丘脑中LKB1和AMPK的磷酸化水平，这两者是SIRT1活性的功能性读数。此外，SIRT1的两个靶基因Ppargc1a和Ox2r的mRNA表达水平在下丘脑中分别显示出显著增加或增加趋势。这些结果共同表明，单次运动后下丘脑中的NAD⁺周转可能显著加快了。为了研究长期运动的影响，研究人员让20月龄的老年小鼠进行为期10周的自愿转轮运动（平均每天约跑4公里）。与对照组相比，长期运动组老年小鼠下丘脑中的NAD⁺水平显著升高。这些发现将运动、循环eNAMPT的增加以及下丘脑NAD⁺代谢的激活联系起来。

人源性eNAMPT-EVs在小鼠中引发生理反应

最后，研究人员研究了人血浆源性eNAMPT-EVs的给药是否不仅能增加下丘脑NAD⁺，还能诱导小鼠的生理反应。下丘脑是自主神经系统的中枢，调节着许多基本的身体功能，包括核心体温。他们发现，在麻醉状态下，静脉注射人eNAMPT-EVs 30分钟后，小鼠的直肠体温维持在显著更高的水平。并且在注射后30分钟时，未观察到TNF-α或IL-6等炎症细胞因子的升高，排除了急性免疫反应导致体温变化的可能性。这种体温升高效应在将人eNAMPT-EVs与FK866预孵育后被消除，表明该效应是由人eNAMPT引起的。已知下丘脑中的神经肽Y(Neuropeptide Y, Npy)参与调节核心体温，并且在下丘脑背内侧核(Dorsomedial Hypothalamus, DMH)敲低Npy会导致体温升高。与此一致的是，研究人员发现，注射人eNAMPT-EVs的正常小鼠下丘脑中Npy的mRNA表达受到抑制，并且这种抑制效应也能被FK866预孵育所逆转。与Npy类似，参与下丘脑能量代谢调节的Agrp基因的mRNA表达水平也对人eNAMPT-EVs和FK866处理表现出相似的变化模式。此外，在清醒状态下的小鼠中，无论是在室温下还是冷暴露后，静脉注射纯化的人eNAMPT-EVs均能观察到体温升高。这些结果共同为人类eNAMPT-EVs在小鼠体内的NAD⁺生物合成活性及其引发的功能性生理反应提供了令人信服的证据。

本研究通过严谨的实验证明，补充人血浆来源的eNAMPT-EVs能够增强下丘脑中的NAD⁺生物合成，并在小鼠体内诱导生理反应（如体温升高）。这种纯化人血浆源性eNAMPT-EVs的NAD⁺生物合成活性可以通过本研究建立的细胞培养生物测定法进行量化。研究结果还强调了运动作为一种生理刺激对提升循环eNAMPT-EVs水平的重要性。考虑到从年轻小鼠血浆纯化的eNAMPT-EVs能够增强老年小鼠下丘脑NAD⁺水平、改善年龄相关功能衰退并延长最大寿命，本研究结果强烈提示人eNAMPT-EVs有潜力作为一种有效的抗衰老NAD⁺增强剂。

值得注意的是，人源性eNAMPT-EVs的给药不仅提高了小鼠下丘脑NAD⁺水平，还引起了下丘脑基因表达的变化，进而导致核心体温升高，这表明eNAMPT-EVs的功能在小鼠和人类之间是保守的。最近的研究表明，下丘脑背内侧的一类特定神经元（DMH^Ppp1r17神经元）通过交感神经系统调节白色脂肪组织功能（包括eNAMPT-EVs的分泌），并在对抗衰老和延长小鼠寿命中发挥关键作用。eNAMPT-EVs也增强DMH和弓状核中的NAD⁺生物合成，从而构成了下丘脑与脂肪组织之间的反馈回路。鉴于循环eNAMPT-EVs可被单次运动增强，并且下丘脑NAD⁺水平在长期运动后显著增加，这一反馈回路很可能不仅参与衰老和寿命控制，也介导了对运动的生理反应。

当然，本研究的所有实验均是在正常小鼠中单次注射人血浆源性EVs完成的，并且未观察到急性免疫激活的迹象，表明观察到的效应并非急性免疫反应所致。然而，由于重复注射EVs可能导致适应性免疫致敏，本研究未评估重复注射的效果。因此，在不久的将来，需要进行谨慎的临床研究来检验高度纯化的人血浆源性EVs是否能作为有效的NAD⁺增强剂并为人类带来健康益处。

EVs中含有许多生物活性物质，包括eNAMPT。在本研究中，由人血浆纯化的EVs所引起的效应必须归因于其中所含eNAMPT的NAD⁺生物合成活性，因为强效的NAMPT抑制剂FK866消除了细胞和组织NAD⁺的增加、下丘脑基因表达的变化以及对小鼠核心体温的影响。尽管FK866也会抑制受体细胞内的NAMPT活性，但研究人员观察到了eNAMPT-EVs给药与FK866处理之间存在显著的统计学交互作用，证明观察到的效应是由EV来源的eNAMPT介导的。由于EVs的内容物可能受脂肪组织代谢状态的影响，因此仔细评估纯化EVs的质量至关重要，这或许能反映释放eNAMPT-EVs的脂肪组织及其他组织的状态。在这方面，本研究建立的生物测定系统将有助于进行此类评估，尽管其动态范围有待进一步提高。

综上所述，本研究重申了eNAMPT-EVs在通过系统性NAD⁺增强开发有效抗衰老干预措施方面的内在价值，从而为实现"有生产力的衰老"(productive aging)铺平了道路，并对其在人类临床环境中的实际应用持谨慎乐观态度。